304 Poslamaýan polatdan kebşirlenen örtükli turba / turbalar himiki zomponenti, Global deňiz mikrobiomasynyň biosintetiki potensialy

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.

Önümiň jikme-jik beýany

304 Poslamaýan polatdan kebşirlenen turba / turba
1. Spesifikasiýa: Poslamaýan polatdan ýasalan turba / turba
2. Görnüşi: kebşirlenen ýa-da bökdençsiz
3. Standart: ASTM A269, ASTM A249
4. Poslamaýan polatdan ýasalan turba OD: 6mm-den 25.4MM
5. Uzynlygy: 600-3500MM ýa-da müşderiniň islegine görä.
6. Diwaryň galyňlygy: 0,2 mm-den 2,0mm.

7. Çydamlylyk: OD: +/- 0.01mm;Galyňlygy: +/- 0.01%.

8. Içki deşik ölçegi: 500MM-1500MM (müşderiniň talaplaryna görä sazlanyp bilner)

9. Bobanyň beýikligi: 200MM-400MM (müşderiniň talaplaryna görä sazlap bolýar)

10. faceüzü: ightagty ýa-da örtülen
11. Material: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, garyndy 625, 825, 2205, 2507 we ş.m.
12. Gaplamak: agaçdan ýasalan torbalar, agaç palet, agaç şah ýa-da müşderiniň islegine görä
13. Synag: himiki komponent, hasyl güýji, dartyş güýji, gatylygy ölçemek
14. Kepillik: Üçünji tarap (mysal üçin: SGS TV) gözden geçirmek we ş.m.
15. Programma: Bezeg, mebel, nebit daşamak, ýylylyk çalşyjy, demir ýasamak, kagyz ýasamak, awtoulag, azyk önümçiligi, lukmançylyk we ş.m.

Tebigy mikrob jemgyýetleri filogenetiki we metaboliki taýdan dürli-dürli.Organizmleriň düşünmedik toparlaryndan başga-da, bu dürlilik ekologiki we biotehnologiki taýdan möhüm fermentleri we biohimiki birleşmeleri tapmak üçin baý potensiala eýe.Şeýle-de bolsa, şeýle birleşmeleri sintezleýän we olary degişli öý eýelerine baglaýan genom ýollaryny kesgitlemek üçin bu dürlüligi öwrenmek kyn mesele bolup galýar.Açyk ummanda mikroorganizmleriň biosintetiki potensialy, dünýä derejesinde genleriň çözgüdi baradaky maglumatlaryň seljermesindäki çäklendirmeler sebäpli köplenç näbelli bolup galýar.Bu ýerde, medeniýetli öýjüklerden we ýeke öýjüklerden takmynan 10,000 mikrob genomyny 1000-den gowrak deňiz suwunyň nusgalaryndan 25 000-den gowrak täze gurlan genom bilen birleşdirip, okeanda biosintetiki gen toparlarynyň dürlüligini we dürlüligini öwrenýäris.Bu tagallalar takmynan 40,000 töweregi esasan täze biosintetiki gen toparlaryny kesgitledi, olaryň käbiri öň garaşylmadyk filogenetiki toparlarda tapyldy.Bu ilat arasynda, ösmedik bakteriýa filumyna degişli bolan we bu gurşawda biosintetiki taýdan dürli görnüşli mikroorganizmleriň käbirini öz içine alýan biosintetiki gen toparlarynda (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) baýlaşdyrylan nesli kesgitledik.Bulardan fosfataz-peptid we pitonamid ýollaryny häsiýetlendirdik, degişlilikde adaty bolmadyk bioaktiw birleşme gurluşynyň we fermentiň ýagdaýlaryny kesgitledik.Sözümiň ahyrynda, bu gözleg mikrobioma esaslanýan strategiýalaryň, öň düşünilmedik fermentleri we tebigy iýmitleri gowy düşünilmedik mikrobiota we gurşawda öwrenmäge mümkinçilik berip biljekdigini görkezýär.
Mikroblar global biogeohimiki siklleri herekete getirýär, iýmit torlaryny saklaýar we ösümlikleri we haýwanlary sagdyn saklaýar5.Olaryň ägirt uly filogenetiki, metabolik we funksional dürlüligi täze taksa1, fermentleri we biohimiki birleşmeleri, şol sanda tebigy önümleri tapmak üçin baý potensialy görkezýär6.Ekologiki jemgyýetlerde bu molekulalar mikroorganizmleri aragatnaşykdan başlap, 2, 7-e çenli dürli fiziologiki we ekologiki funksiýalar bilen üpjün edýär.Asyl funksiýalaryna goşmaça, bu tebigy önümler we genetiki taýdan kodlanan önümçilik ýollary biotehnologiki we bejeriş amaly üçin mysallar berýär2,3.Şeýle ýollary we baglanyşyklary kesgitlemek, medeniýetli mikroblary öwrenmek arkaly aňsatlaşdyryldy.Şeýle-de bolsa, tebigy gurşawyň taksonomiki gözlegleri mikroorganizmleriň aglaba köplüginiň ösdürilmändigini görkezdi8.Bu medeni tarap, köp mikroblar bilen kodlanan funksional dürlüligi ulanmak ukybymyzy çäklendirýär4,9.
Bu çäklendirmeleri ýeňip geçmek üçin soňky on ýylda tehnologiki ösüşler gözlegçilere gönüden-göni (ýagny, öň medeniýetsiz) mikroblaryň DNK böleklerini (metagenomika) ýa-da bir öýjükden yzygiderli almaga mümkinçilik berdi.Bu bölekleri has uly gen böleklerine ýygnamak we birnäçe metagenomiki taýdan ýygnalan genomlary (MAGs) ýa-da ýeke-täk güýçlendirilen genleri (SAG) täzeden gurmak ukyby, mikrobiomanyň (ýagny, mikrob jemgyýetleri we mikrobioma) taksentrik gözlegleri üçin möhüm mümkinçilik açýar.täze ýollar açyň.berlen gurşawda öz genetiki materialy) 10,11,12.Hakykatdanam, soňky gözlegler Earther 1, 13-de mikrob dürlüliginiň filogenetiki görnüşini ep-esli giňeltdi we medeni mikroorganizmlere salgylanma genom yzygiderliligi (REFs) 14 bilen örtülmedik aýratyn mikrob jemgyýetlerinde köp funksional dürlüligi ýüze çykardy.Açylmadyk funksional dürlüligi kabul ediji geniň (ýagny, gen çözgüdi) kontekstinde ýerleşdirmek ukyby, täze tebigy önümleri15,16 kodlaýan, entek häsiýetlendirilmedik mikrob çyzyklaryny çaklamak ýa-da şular ýaly birleşmeleri asyl öndürijisine gözlemek üçin möhümdir.Mysal üçin, birleşdirilen metagenomiki we bir öýjükli genom seljermesi çemeleşmesi, metabolik taýdan baý gubka bilen baglanyşykly bakteriýalaryň topary bolan Candidatus Entotheonellanyň dürli neşe potensialynyň öndürijisi hökmünde kesgitlenmegine sebäp boldy18.Şeýle-de bolsa, dürli mikrob jemgyýetleriniň genom gözleginde soňky synanyşyklara garamazdan, Eartheriň iň uly ekosistemalar ummany üçin global metagenomiki maglumatlaryň üçden iki böleginden 16,19-sy henizem ýok.Şeýlelik bilen, umuman aýdylanda, deňiz mikrobiomasynyň biosintetiki potensialy we täze ferment we tebigy önümleriň ammary hökmünde onuň potensialy kän bir düşünilmän galýar.
Dünýädäki deňiz mikrobiomalarynyň biosintetiki potensialyny öwrenmek üçin ilki bilen filogenetikanyň we gen funksiýasynyň giňişleýin maglumatlar binýadyny döretmek üçin medeniýete bagly we medeni däl usullardan peýdalanyp alnan deňiz mikrob genomlaryny jemledik.Bu maglumat bazasynyň gözden geçirilmegi, biosintetiki gen toparlarynyň (BGC) köp bölegi ýüze çykaryldy, olaryň köpüsi entek häsiýetlendirilmedik gen klasterleri (GCF) maşgalalaryna degişlidir.Mundan başga-da, şu güne çenli açyk ummanda BGC-leriň iň köp dürlüligini görkezýän näbelli bakteriýa maşgalasyny kesgitledik.Iki ribosomal sintez we terjime edilenden soň üýtgedilen peptid (RiPP) ýollaryny, häzirki belli ýollardan genetiki tapawutlaryna esaslanyp synag synaglary üçin saýladyk.Bu ýollaryň funksional häsiýetnamasy fermentleriň garaşylmadyk mysallaryny, şeýle hem proteaz inhibitor işjeňligi bilen gurluş taýdan üýtgeşik birleşmeleri ýüze çykardy.
Ilki bilen, bakteriýa we arheal komponentlerine ünsi jemläp, gen analizi üçin global maglumat çeşmesini döretmegi maksat edindik.Bu maksat bilen, dünýäde paýlanan 215 nusga giňişliginden (giňişlik aralygy = 141,6 °) we birnäçe çuň gatlakdan (çuňlugy 1-den 5600 metre çenli), metagenomiki maglumatlary we 1038 deňiz suwunyň nusgalaryny jemledik, pelagiki, mezopelagiki we abysal zolaklary öz içine alýar).Fon21,22,23 (1a surat, giňeldilen maglumatlar, 1a surat we goşmaça tablisa 1).Giň geografiki gurşawy üpjün etmekden başga-da, saýlanan süzülen bu nusgalar, deňiz mikrobiomasynyň dürli komponentlerini, şol sanda wirusa baý (<0,2 µm), prokaryotiklere baý (0,2–3 mk), bölejiklere baý (0,8 µm) deňeşdirmäge mümkinçilik berdi. ).–20 µm) we wirus ýok edilen (> 0,2 mk) koloniýalary.
a, Dünýäde paýlanan 215 ýerden (62 ° S-den 79 ° N we 179 ° W-dan 179 ° E çenli) toplanan deňiz mikrob jemgyýetleriniň jemi 1038 genomy (metagenomika).Karta plitalary © Esri.Çeşmeler: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ we Esri.b, bu metagenomlar maglumatlar bazasyndaky mukdar we hil (usullar) bilen tapawutlanýan (reňk bilen bellenen) MAG-lary (usullar we goşmaça maglumatlar) täzeden gurmak üçin ulanyldy.Dikeldilen MAG-lar köpçülige elýeterli (daşarky) genomlar, şol sanda elde öndürilen MAG26, SAG27 we REF bilen dolduryldy.27 OMD düzüň.c, diňe SAG (GORG) 20 ýa-da MAG (GEM) 16 esasly hasabatlar bilen deňeşdirilende, OMD deňiz mikrob jemgyýetleriniň genom häsiýetnamasyny (metagenomiki okamagyň kartalaşdyryş tizligi; usuly) çuňlugynda has yzygiderli wekilçilik bilen iki-üç esse ýokarlandyrýar we giňişlik..<0.2, n = 151, 0.2-0.8, n = 67, 0.2-3, n = 180, 0.8-20, n = 30,> 0.2, n = 610, <30 °, n = 132, 30–60 ° , n = 73,> 60 °, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD görnüşleriň toparlara bölünişi (95% nukleotid şahsyýetini aňladýar) jemi kesgitleýär takmynan 8300 görnüş, olaryň ýarysyndan gowragy GTDB (89 wersiýa) e ulanyp taksonomik düşündirişlere görä häsiýetlendirilmedi, görnüşleriň gen görnüşi boýunça toparlara bölünmegi MAG, SAG we REF-leriň filogenetiki dürlüligini görkezmekde biri-birini doldurýandygyny görkezdi. deňiz mikrobiome.Hususan-da, görnüşleriň 55%, 26% we 11% degişlilikde MAG, SAG we REF üçin mahsusdy.BATS, Bermuda Atlantik Wagt seriýasy;GEM, Eartheriň mikrobiomynyň genomlary;GORG, ummanyň global genomy;HOT, Gawaýi ummanynyň wagt seriýasy.
Bu maglumatlar binýadyny ulanyp, jemi 26,293 MAG-ny täzeden gurduk, esasan bakterial we arheal (1b surat we giňeldilen maglumatlar, 1b surat).Bu MAG-lary dürli ýerlerden ýa-da wagt nokatlaryndan (usullaryndan) nusgalaryň arasynda tebigy yzygiderliligiň üýtgemeginiň öňüni almak üçin birleşdirilen metagenomiki nusgalardan däl-de, aýry-aýrylardan ýygnadyk.Mundan başga-da, köp sanly nusgalarda (gözlegiň usulyna baglylykda 58-den 610-a çenli nusga) ýaýramagynyň korrelýasiýalaryna esaslanyp genom böleklerini toparladyk.Munuň köp wagt talap edýän, ýöne möhüm ädim24 bolandygyny gördük, birnäçe uly göwrümli MAG16, 19, 25 rekonstruksiýa işlerinde geçip, mukdaryny (ortaça 2,7 esse) we hilini (ortaça + 20%) ep-esli ýokarlandyrýar. genom.bu ýerde öwrenilen deňiz metagenomyndan dikeldildi (giňeldilen maglumatlar, 2a surat we goşmaça maglumatlar).Umuman aýdanyňda, bu tagallalar häzirki wagtda bar bolan iň giňişleýin MAG çeşmesi bilen deňeşdirilende deňiz mikrob MAG-larynyň (diňe ýokary hilli MAG-lary göz öňünde tutulsa 6 esse) 4,5 esse ýokarlanmagyna getirdi16 (Usullar).Täze döredilen MAG toplumy soňra 830 el bilen saýlanan MAG26, 5969 SAG27 we 1707 REF bilen birleşdirildi.Deňiz bakteriýalarynyň we arhaýanyň ýigrimi ýedi görnüşi 34,799 genomyň kombinator ýygyndysyny emele getirdi (1-nji surat).
Soňra deňiz mikrob jemgyýetlerine wekilçilik etmek we dürli gen görnüşlerini birleşdirmegiň täsirine baha bermek üçin täze döredilen çeşmä baha berdik.Orta hasap bilen, deňiz metagenomiki maglumatlarynyň takmynan 40-60% -ini öz içine alýandygyna göz ýetirdik (1c surat), diňe MAG-yň diňe hasabatlarynyň çuňlugynda we giňişliginde iki-üç esse köp seriýa 16 ýa-da SAG20.Mundan başga-da, döredilen ýygyndylarda taksonomiki dürlüligi yzygiderli ölçemek üçin, Genomyň taksonomiýa maglumatlar bazasy (GTDB) gurallar toplumyny (usullaryny) ulanyp, ähli genomlary bellik etdik we ortaça 95% genomly nukleotid şahsyýetini ulandyk.28304 görnüş toparyny (görnüşini) kesgitlemek üçin 28.Bu görnüşleriň üçden iki bölegi (täze klasslary goşmak bilen) GTDB-de öň peýda bolmandyr, şolardan 2790-sy bu işde dikeldilen MAG-dan peýdalanyp tapyldy (1-nji surat).Mundan başga-da, dürli görnüşli genomlaryň biri-biriniň üstüni ýetirýändigini gördük: görnüşleriň 55%, 26% we 11% degişlilikde MAG, SAG we REF-den ybaratdyr (1e surat).Mundan başga-da, MAG suw sütüninden tapylan 49 görnüşiň hemmesini öz içine aldy, SAG we REF degişlilikde diňe 18 we 11-ni görkezýärdi.Şeýle-de bolsa, SAG Pelagic Bakteriales (SAR11) ýaly iň köp ýaýran klasslaryň (giňeldilen maglumatlar, 3a surat) dürlüligini has gowy görkezýär, SAG 1300 görnüşi we MAG diňe 390 görnüşi öz içine alýar.REeri gelende aýtsak, REF-ler görnüşler derejesinde MAG ýa-da SAG-lar bilen seýrek gabat gelýär we bu ýerde öwrenilen açyk ummanyň metagenomiki toplumlarynda tapylmaýan takmynan 1000 genomyň 95% -ini görkezýär, esasan beýleki izolirlenen deňiz nusgalarynyň beýleki görnüşleri (mysal üçin çökündiler). .ýa-da öý eýesi).Ylmy jemgyýetçilige giňden elýeterli etmek üçin, bölünmedik bölekleri (mysal üçin, çak edilýän tapgyrlardan, genom adalaryndan we MAG rekonstruksiýasy üçin ýeterlik maglumat ýok bolan gen böleklerinden) öz içine alýan bu deňiz genom çeşmesini taksonomiki maglumatlar bilen deňeşdirip bolar. .Okeanyň mikrobiologiýa maglumatlar bazasyndaky gen funksiýasy we kontekst parametrleri bilen birlikde düşündirişlere giriň (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Soňra açyk ummanyň mikrobiomalarynda biosintetiki potensialyň baýlygyny we täzeligini öwrenmäge başladyk.Bu maksat bilen, jemi 39 055 BGC-ni çaklamak üçin ilki bilen 1038 deňiz metagenomynda (usullary) tapylan ähli MAG, SAG we REF-ler üçin antiSMASH ulandyk.Soňra bulary artykmaç artykmaçlygy hasaba almak üçin 6907 gereksiz GCF we 151 gen klaster populýasiýasyna (GCC; goşmaça tablisa 2 we usullar) toparladyk, ýagny şol bir BGC birnäçe genomda kodlanyp bilner) we metagenomiki maglumatlar Konsentrirlenen BGC-leriň bölünişi.Doly däl BGC-ler, 44% we 86% ýagdaýynda azyndan bir bitewi BGC agzasyny öz içine alýan GCF-leriň we GCC-leriň sany ep-esli artmady.
GCC derejesinde çaklanylýan RiPP-leriň we beýleki tebigy önümleriň köp görnüşini tapdyk (2a surat).Olaryň arasynda, mysal üçin, arilpolienler, karotinoidler, ektoinler we sideroforlar giň filogenetiki paýlanyşy we okean metagenomlarynda köp mukdarda GCC-lere degişlidir, bu mikroorganizmleriň deňiz gurşawyna giň uýgunlaşmagyny, şol sanda reaktiw kislorod görnüşlerine garşylygy görkezip biler, oksidleýji we osmotik stres..ýa-da demiriň siňdirilmegi (has giňişleýin maglumat).Bu funksional dürlilik, NCBI RefSeq maglumatlar bazasynda (BiG-FAM / RefSeq, mundan beýläk RefSeq diýlip atlandyrylýar) 29-da saklanýan takmynan 190,000 genomyň arasynda takmynan 1,2 million BGC-leriň seljermesi bilen tapawutlanýar, bu bolsa nonribosomal sintetaza peptidleriň (NRPS) we poliketid sintazyny görkezýär (PKS) BGCs (Goşmaça maglumat).Şeýle hem, 44 (29%) GCC-ni diňe islendik RefSeq BGC (\ (\ bar {d} \) RefSeq> 0.4; 2a surat we usullar) we 53 (35%) GCC-ni diňe MAG-da tapdyk, potensialy görkezýäris. OMD-de öň ýazylmadyk himiki maddalary tapmak.Bu GK-laryň hersiniň ýokary dürli biosintetiki funksiýalary aňladýandygyny göz öňünde tutup, şuňa meňzeş tebigy önümleriň kody bilen çaklanylýan BGC-leriň has jikme-jik toparlanmagyny üpjün etmek maksady bilen GCF derejesinde maglumatlary hasam seljerdik29.Jemi 3861 (56%) kesgitlenen GCF-leriň RefSeq bilen gabat gelmändigi, we synagdan geçen BGC-leriň iň uly maglumat bazalarynyň biri bolan MIBiG-de GCF-leriň 97% -i ýokdy (2b surat).Salgy genomy bilen gowy görkezilmedik sazlamalarda köp potensial täze ýollary tapmak geň däl bolsa-da, bahalandyrmazdan ozal BGC-leri GCF-lerden çykarmak usulymyz öňki hasabat 16-dan tapawutlanýar we täzelige bitarap baha bermäge mümkinçilik berýär.Täze dürlüligiň köpüsi (3012 GCF ýa-da 78%) çak edilýän terpenlere, RiPP ýa-da beýleki tebigy önümlere gabat gelýär we köpüsi (1815 GCF ýa-da 47%) biosintetiki potensialy sebäpli näbelli görnüşlerde kodlanýar.PKS we NRPS toparlaryndan tapawutlylykda, bu ykjam BGC-ler 31-nji metagenomiki gurnama wagtynda böleklere bölünip bilmeýär we önümleriniň has köp wagt we serişde talap edýän funksional häsiýetnamasyna mümkinçilik berýär.
Jemi 39 055 BGC 6,907 GCF we 151 GCC toparlara bölünipdi.a, maglumatlary görkezmek (içerki daşarky).GCC esasly BGC aralyklaryň iýerarhiki toparlanyşygy, olaryň 53-si diňe MAG tarapyndan kesgitlenýär.GCC dürli taksalardan (ln üýtgedilen derwezäniň ýygylygy) we dürli BGC synplaryndan (tegelegiň ululygy ýygylygyna laýyk gelýär) BGC-leri öz içine alýar.Her GCC üçin daşarky gatlak BGC-leriň sanyny, ýaýramagyny (nusgalaryň göterimi) we BiG-FAM-dan BGC-e çenli aralygy (iň az BGC kosin aralygy (min (dMIBiG))) aňladýar.Synagda barlanan BGC-ler (MIBiG) bilen ýakyndan baglanyşykly BGC-ler bilen GCC-ler oklar bilen tapawutlanýar.b GCF-ni çaklanylýan (BiG-FAM) we tejribe taýdan tassyklanan (MIBiG) BGC-ler bilen deňeşdirip, 3861 täze (d–> 0.2) GCF tapyldy.RiPP, terpenler we beýleki amatly tebigy önümler üçin bu kodlaryň köpüsi (78%).c, OMD-de 1038 deňiz metagenomyndan tapylan ähli genomlar, OMD-iň filogenetiki örtügini görkezmek üçin GTDB esasy agajyna ýerleşdirildi.OMD-de hiç hili genom bolmadyk pyçaklar çal reňkde görkezilýär.BGC-leriň sany, belli bir klassdaky genom üçin çak edilýän BGC-leriň iň köp sanyna gabat gelýär.Has düşnükli bolmak üçin düwünleriň soňky 15% -i ýykylýar.Oklar, Mikobakteriýadan, Gordoniýadan (Rodokokkdan soň ikinji ýerde) we Krokosferadan (Sinekokokkdan soň ikinji) BGC (> 15 BGC) baý klasslary görkezýär.d, näbelli c.Eremiobacterota iň ýokary biosintetiki dürlüligi görkezdi (tebigy önümiň görnüşine esaslanýan Şannon indeksi).Her topar görnüşdäki iň köp BGC bilen genomy aňladýar.T1PKS, PKS görnüşi I, T2 / 3PKS, PKS görnüşi II we III görnüşi.
Baýlykdan we täzelikden başga-da, deňiz mikrobiomasynyň biosintetiki potensialynyň biogeografiki gurluşyny öwrenýäris.Nusgalary ortaça metagenomiki GCF göçürme sanlarynyň paýlanyşy boýunça toparlara bölmek (Usullar) pes giňişlik, ýerüsti, prokaryotiklere baý we wirusa mätäç jemgyýetleriň, esasan, ýerüsti ýa-da has çuňňur gün suwlaryndan RiPP we BGC terpenlerine baýdygyny görkezdi.Munuň tersine, polýar, çuň deňiz, wirus we bölejiklere baý jemgyýetler köp mukdarda NRPS we PKS BGC bilen baglanyşyklydy (giňeldilen maglumatlar, 4-nji surat we goşmaça maglumatlar).Ahyrynda, gowy öwrenilen tropiki we pelagiki jemgyýetleriň täze terpenleriň iň geljegi uly çeşmesidigine göz ýetirdik (Giňeldilen maglumatlar şekili).PKS, RiPP we beýleki tebigy önümler üçin iň ýokary potensial (Giňeldilen maglumatlar bilen 5a surat).
Deňiz mikrobiomalarynyň biosintetiki potensialyny öwrenmek üçin olaryň filogenetiki paýlanyşyny kartalaşdyrmagy we BGC bilen baýlaşdyrylan täze klasslary kesgitlemegi maksat edindik.Bu maksat bilen, deňiz mikroblarynyň genomlaryny kadalaşdyrylan GTDB13 bakteriýa we arheal filogenetiki agaja ýerleşdirdik we kodlaýan biosintetiki ýollaryny örtdük (2-nji surat).Sianobakteriýalar (Synechococcus) we Tistrella32,33 ýaly protein bakteriýalary ýaly biosintetiki potensialy bilen tanalýan deňiz suwlarynyň nusgalarynda (15-den gowrak BGC bilen aňladylýar) BGC bilen baýlaşdyrylan birnäçe klasslary aňsatlyk bilen tapdyk ýa-da ýakynda olaryň ünsüni çekdik. tebigy önümler.Myxococcota (Sandaracinaceae), Rodokokk we Planctomycetota34,35,36 ýaly.Gyzykly tarapy, bu klasslarda ozal öwrenilmedik birnäçe nesil tapdyk.Mysal üçin, “Planctomycetota” we “Myxococcota” phyla biosintetiki potensialyna eýe bolan bu görnüşler degişlilikde häsiýetlendirilmedik kandidat buýruklaryna we görnüşlerine degişlidir (Goşmaça tablisa 3).Bu, OMD-iň ferment we tebigy önümi açmak üçin täze nyşanlary görkezip biljek mikroorganizmleri goşmak bilen ozal näbelli filogenetiki maglumatlara elýeterliligi üpjün edýändigini görkezýär.
Ondan soň, BGC bilen baýlaşdyrylan klassy diňe bir agzalary tarapyndan kodlanan BGC-leriň sanyny sanamak bilen çäklenmän, eýsem tebigy kandidat önümleriniň dürli görnüşleriniň ýygylygyny düşündirýän bu BGC-leriň dürlüligine baha bermek bilen häsiýetlendirdik (2c-nji surat we usullar) )..Bu gözlegde biosintetiki taýdan dürli görnüşli görnüşleriň ýörite ineredener edilen bakterial MAG-lary bilen görkezilendigini gördük.Bu bakteriýalar, birnäçe genom gözleglerinden başga-da köp öwrenilmedik kandidatus Eremiobacterota, ösmedik phylum Candidatus Eremiobacterota degişlidir.“Ca.Eremiobacterota urugy diňe ýerüsti gurşawda seljerildi39 we BGC-de baýlaşdyrylan agzalaryň ýokdugy belli däl.Bu ýerde şol bir görnüşdäki sekiz MAG-ny täzeden gurduk (nukleotid şahsyýeti> 99%) 23. Şonuň üçin grek mifologiýasynda we ekspedisiýalarynda ajaýyp sowgat bolan nereidiň (deňiz nymfasy) adyny göterýän “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii” görnüşini teklip edýäris.'Ka.Filogenetiki düşündiriş 13-e görä, E. malaspinii-iň yzygiderlilik derejesinden ozal belli garyndaşlary ýok we şonuň üçin biz “Ca.” teklip edýän täze bakteriýa maşgalasyna degişlidir.E. malaspinii ”görnüşi we“ Ca.Eudormicrobiaceae ”resmi ady hökmünde (Goşmaça maglumatlar).'Ca.-nyň gysga metagenomiki rekonstruksiýasy.E. malaspinii gen taslamasy gaty pes giriş, uzak okalýan metagenomiki yzygiderlilik we 75 kb köpeltmek bilen bir 9,63 Mb çyzykly hromosoma hökmünde bir nusganyň (Usullaryň) maksatly ýygnalmagy bilen tassyklandy.galan düşnüksizlik hökmünde.
Bu görnüşiň filogenetiki kontekstini kesgitlemek üçin, Tara ummany ekspedisiýasyndan maksatly gen rekonstruksiýasy arkaly goşmaça eukariotik bilen baýlaşdyrylan metagenomiki nusgalarda ýakyn baglanyşykly 40 görnüşi gözledik.Gysgaça, metagenomiki okaýyşlary “Ca.” bilen baglanyşykly genom bölekleri bilen baglanyşdyrdyk.E. malaspinii ”we bu nusgada işe alynmagyň derejesiniň ýokarlanmagy beýleki garyndaşlaryň (usullaryň) bardygyny çaklaýar.Netijede, täze kesgitlenen maşgalanyň içinde (ýagny “Ca. Eudormicrobiaceae”) üç görnüşdäki bäş görnüşi görkezýän 19 MAG-laryň kombinasiýasy bolan 10 MAG tapdyk.El bilen gözden geçirmekden we hil gözegçiliginden soň (giňeldilen maglumatlar, 6-njy surat we goşmaça maglumatlar) “Ca.Eudormicrobiaceae görnüşleri beýleki “Ca” agzalaryna garanyňda has uly genomlary (8 Mb) we has baý biosintetiki potensialy (her görnüş üçin 14 - 22 BGC) hödürleýär.Klade Eremiobacterota (7 BGC çenli) (3a - c).
a, bäş 'Ca-nyň filogenetiki pozisiýalary.“Eudormicrobiaceae” görnüşleri, bu işde kesgitlenen deňiz çyzyklaryna mahsus BGC baýlygyny görkezdi.Filogenetik agajyň hemmesine 'Ca.MAG Eremiobacterota we GTDB-de (89-njy wersiýa) berlen beýleki phyla (ýaýyň genom sanlary) agzalary ewolýusiýa fonunda (Usullar) ulanyldy.Daşarky gatlaklar maşgala derejesinde (“Ca. Eudormicrobiaceae” we “Ca. Xenobiaceae”) we synp derejesinde (“Ca. Eremiobacteria”) klassifikasiýalary aňladýar.Bu gözlegde beýan edilen bäş görnüş elipbiý kodlary we teklip edilýän binomial atlar (Goşmaça maglumatlar) bilen aňladylýar.b, bolýar.Eudormicrobiaceae görnüşleri ýedi sany umumy BGC ýadrosyny paýlaşýar.A2 klada BGC-iň ýoklugy wekil MAG-nyň doly dälligi bilen baglanyşyklydy (Goşmaça tablisa 3).BGC-ler “Ca.Amfitomikrobium ”we“ Ca.Amfitomikrobium ”(A we B klasslar) görkezilmeýär.c, Bhli BGC kodlary “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii, Tara okeanlaryndan alnan 623 metatranscriptde ýüze çykaryldy.Gaty tegelekler işjeň transkripsiýany görkezýär.Mämişi tegelekler, öý hyzmatynyň gen aňlatma tizliginiň (usullarynyň) aşagynda we ýokarsynda log2 üýtgedilen ep-esli üýtgemeleri aňladýar.d, deňeşdirilen bolçulyk egrileri (usullary) 'Ca.“Eudormicrobiaceae” görnüşleri ummanyň basseýnleriniň köpüsinde we tutuş suw sütüninde (ýerden azyndan 4000 m çuňluga çenli) giňden ýaýrandyr.Bu bahalandyrmalara esaslanyp, 'Ca.E. malaspinii 'deňizdäki pelagiki däne bilen baglanyşykly jemgyýetlerde prokaryotik öýjükleriň 6% -ini tutýar.Belli bir çuňluk gatlagynyň ululygynyň haýsydyr bir böleginde tapylan bolsa, bir ýerde bir görnüşi bar diýip hasapladyk.IO - Hindi ummany, NAO - Demirgazyk Atlantik, NPO - Demirgazyk Pacificuwaş ummany, RS - Gyzyl deňiz, SAO - Günorta Atlantik, SO - Günorta Okean, SPO - Günorta Pacificuwaş ummany.
Ca-nyň bollygyny we paýlanyşyny öwrenmek.Oud basseýnleriniň köpüsinde, şeýle hem tutuş suw sütüninde agdyklyk edýän “Eudormicrobiaceae” (3-nji surat).Allyerli derejede deňiz mikroblar jemgyýetiniň 6% -ini emele getirýär we olary global deňiz mikrobiomasynyň möhüm bölegine öwürýär.Mundan başga-da, Ca-nyň deňeşdirilen mazmunyny tapdyk.Eudormicrobiaceae görnüşleri we olaryň BGC aňlatma derejeleri eukariotik bilen baýlaşdyrylan fraksiýada iň ýokarydy (3-nji surat we giňeldilen maglumatlar, 7-nji surat), plankton ýaly bölejik maddalary bilen bolup biläýjek täsirini görkezýär.Bu syn, "Ca" bilen birneme meňzeýär.Belli ýollar arkaly sitotoksiki tebigy önümleri öndürýän Eudoremicrobium BGCs, Myxococcus41 ýaly metabolitleri öndürýän beýleki ýyrtyjylara meňzeş ýyrtyjy häsiýetleri görkezip biler (Goşmaça maglumatlar we giňeldilen maglumatlar, 8-nji surat).Ca-nyň tapylmagyProkaryotik nusgalary däl-de, has az elýeterli (çuň okeanda) ýa-da eukariotik bolan Eudormicrobiaceae, bu bakteriýalaryň we garaşylmadyk BGC dürlüliginiň tebigy iýmit gözlegleriniň çäginde nämälim bolup galýandygyny düşündirip biler.
Netijede, täze ýollary, fermentleri we tebigy önümleri tapmakda mikrobioma esasly işimiziň beren wadasyny synagdan geçirmäge synanyşdyk.BGC-leriň dürli synplarynyň arasynda RiPP ýoly, esasy peptidiň ýetişen fermentler tarapyndan terjimeden soňky üýtgemeleri sebäpli baý himiki we funksional dürlüligi kodlaýandygy mälimdir42.Şeýdip, iki sany Ca saýladyk.Eudoremicrobium 'RiPP BGCs (3b we 4a-e suratlar) belli BGC (\ (\ bar {d} \) MIBiG we \ (\ bar {d} \) RefSeq 0,2-den ýokary) esaslanýar.
a - c, In vitro heterologiki aňlatma we romanyň vitro ferment gözlegleri (\ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.29) çuň deňiz Ca görnüşleri üçin RiPP biosintezi topary.E. malaspinii 'difosforirlenen önümleriň öndürilmegine sebäp boldy.c, ýokary çözgütli (HR) MS / MS (himiki gurluşda b we y ionlary bilen görkezilen bölekler) we NMR (giňeldilen maglumatlar, 9-njy surat) ulanyp kesgitlenen üýtgeşmeler.d, bu fosforlyatlandyrylan peptid, gözegçilik peptidinde we suwsuzlandyryjy peptidde ýok bolan süýdemdirijileriň neýtrofil elastazynyň pes mikromolýar inhibisiýasyny görkezýär (himiki aýyrmak bilen suwsuzlanmagy).Synag şuňa meňzeş netijeler bilen üç gezek gaýtalandy.Mysal üçin, ikinji romanyň \ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.33) belok biosintezi toparynyň heterologiki aňlatmasy 46 aminokislotaly ýadro peptidini üýtgedýän dört ýetişen fermentiň işini düşündirýär.Galyndylar HR-MS / MS tarapyndan çaklanylýan üýtgeşme sahypasyna, izotop belliklerine we NMR derňewine (Goşmaça maglumatlar) görä reňklenýär.Düşülen reňk, üýtgeşmäniň iki galyndyda-da bolandygyny görkezýär.Bu şekil, bir ýadrodaky ähli ýetişen fermentleriň işjeňligini görkezmek üçin köp sanly heterologiki gurluşlaryň jemidir.h, N-metilizasiýanyň arasynda oňurga üçin NMR maglumatlarynyň şekili.Doly netijeler injirde görkezilýär.Giňeldilen maglumatlar bilen 10.i, MIBiG 2.0 maglumatlar bazasynda tapylan ähli FkbM domenleriniň arasynda ýetişen FkbM belok klaster fermentiniň filogenetiki ýagdaýy, bu maşgalanyň N-metiltransferaza işjeňligi bolan fermenti açýar (Goşmaça maglumatlar).BGC-leriň (a, e), deslapky peptid gurluşlarynyň (b, f) we tebigy önümleriň (c, g) himiki gurluşlarynyň shemasy görkezilýär.
Ilkinji RiPP ýoly (\ (\ bar {d} \) MIBiG = 0.41, \ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.29) diňe çuň deňiz görnüşlerinde “Ca.E. malaspinii ”we Peptid-prekursor üçin kodlar (4a surat, b).Bu ýetişen fermentde, fosforilýasiýany katalizleşdirýän we 43-den soň aýrylmagyny üpjün edýän lantipeptid sintazyň suwsuzlandyryş domenine birmeňzeş funksional domeni kesgitledik (Goşmaça maglumatlar).Şonuň üçin deslapky peptidiň üýtgemeginiň şeýle iki basgançakly suwsuzlanmagy öz içine alýandygyny çaklaýarys.Şeýle-de bolsa, tandemiň köpçülik spektrometri (MS / MS) we ýadro magnit-rezonans spektroskopiýasy (NMR) ulanyp, polifosforirlenen çyzykly peptidi kesgitledik (4c-nji surat).Garaşylmadyk bolsa-da, onuň ahyrky önüm bolmagyny tassyklaýan birnäçe subutnama tapdyk: iki dürli heterologiki ýer eýesi we vitro barlaglarynda suwsuzlyk ýok, ýetişen fermentiň katalitik suwsuzlandyryş ýerinde üýtgän esasy galyndylary kesgitlemek.hemmesi “Ca” tarapyndan täzeden guruldy.E. malaspinii genomy (giňeldilen maglumatlar, 9-njy surat we goşmaça maglumatlar) we ahyrsoňy fosforirlenen önümiň biologiki işjeňligi, ýöne himiki taýdan sintezlenen suwsuzlandyrylan görnüş däl (4d-nji surat).Aslynda, ekologiki roluň düşündirilmelidigine garamazdan, konsentrasiýa aralygyndaky (IC50 = 14.3 μM) 44 beýleki tebigy önümler bilen deňeşdirilende, neýtrofil elastaza garşy pes mikromolýar proteaz inhibitor işjeňligini görkezýändigini gördük.Bu netijelere esaslanyp, ýoluň adyny “fosfetin” diýip atlandyrmagy teklip edýäris.
Ikinji ýagdaý, “Ca” -a mahsus çylşyrymly RiPP ýoludyr.Eudoremicrobium (\ (\ bar {d} \) MIBiG = 0.46, \ (\ bar {d} \) RefSeq = 0.33) jynsynyň tebigy belok önümlerini kodlamagy çak edilýärdi (4e surat).Bu ýollar garaşylýan dykyzlygy we BGCs45 bilen kodlanan fermentler tarapyndan döredilen adaty bolmadyk himiki üýtgeşmeleriň dürlüligi sebäpli aýratyn biotehnologiki gyzyklanma döredýär.Bu belogyň ozal häsiýetlendirilen beloklardan tapawutlanýandygyna göz ýetirdik, sebäbi poliseramidleriň esasy NX5N sebäbiniň we 46-njy landornamidiň lanthion aýlawynyň ýoklugy.Umumy heterologiki aňlatma nagyşlarynyň çäklendirmelerini ýeňip geçmek üçin, dört sany ýetişen ýol fermentini (usuly) häsiýetlendirmek üçin adaty Microvirgula aerodenitrificans ulgamy bilen bilelikde ulandyk.MS / MS, izotop belgilemesi we NMR kombinasiýasyny ulanyp, bu ýetişen fermentleri peptidiň 46 aminokislotaly ýadrosynda tapdyk (4f surat, g, giňeldilen maglumatlar, 10–12-nji suratlar we goşmaça maglumatlar).Matureetişen fermentleriň arasynda FkbM O-metiltransferaza maşgala agzasynyň 47-siniň RiPP ýolunda ilkinji ýüze çykmagyny häsiýetlendirdik we garaşylmadyk ýagdaýda bu ýetişen fermentiň oňurgaly N-metilizasiýany girizýändigini gördük (4h surat, i we goşmaça maglumatlar).Bu üýtgetme tebigy NRP48 önümlerinde mälim bolsa-da, amid baglanyşyklarynyň ferment N-metilizasiýasy çylşyrymly, ýöne biotehnologiki taýdan ähmiýetli reaksiýa 49, şu wagta çenli borosinleriň RiPP maşgalasy üçin gyzyklanma döredýär.Aýratynlygy 50,51.Bu işjeňligi fermentleriň we RiPP-iň beýleki maşgalalarynda kesgitlemek täze programmalary açyp biler we 52 beloklaryň funksional dürlüligini we himiki dürlüligini giňeldip biler.Kesgitlenen üýtgeşmelere we teklip edilýän önüm gurluşynyň adaty bolmadyk uzynlygyna esaslanyp, “pifonamid” ýol adyny teklip edýäris.
Funksiýa taýdan häsiýetlendirilen fermentler maşgalasynda garaşylmadyk fermentiň tapylmagy, täze açyşlar üçin daşky gurşaw genomikasynyň wadasyny görkezýär, şeýle hem diňe yzygiderlilik gomologiýasyna esaslanýan funksional gözlegiň çäkliligini görkezýär.Şeýlelik bilen, netijelerimiz kanon däl bioaktiw polifosforirlenen RiPP-leriň hasabatlary bilen bilelikde, biohimiki birleşmeleriň funksional baýlygyny, dürlüligini we üýtgeşik gurluşlaryny doly açmak üçin sintetiki biologiýa tagallalaryna serişde talap edýän, ýöne möhüm ähmiýete eýe.
Bu ýerde, mikroblar bilen kodlanan biosintetiki potensialyň diapazonyny we olaryň genom kontekstini global deňiz mikrobiomasynda görkezýäris, netijede çeşmäni ylmy jemgyýetçilige elýeterli etmek arkaly geljekki gözlegleri ýeňilleşdirýäris (https://microbiomics.io/ocean/).Filogenetiki we funksional täzelikleriniň köpüsini diňe MAG we SAG-lary täzeden gurmak arkaly alyp boljakdygyny, esasanam geljekki bioprospektiw tagallalaryna ýol görkezip biljek ulanylmadyk mikrob jemgyýetlerinde gazanyp boljakdygyny gördük.Bu ýerde ünsi jemläris.“Eudormicrobiaceae” nesli, esasanam biosintetiki taýdan “zehinli” hökmünde, açylmadyk mikrobiotada çaklanylýan BGC-leriň köpüsi, daşky gurşaw we / ýa-da biotehnologiki taýdan möhüm hereketler bilen birleşmeler döredýän öň bellenmedik fermentleri kodlaýar.
Esasy okeanografiki we ýeterlik yzygiderli çuňlugy bolan gözlegleriň metagenomiki maglumatlar bazalary, deňiz deňiz mikrob jemgyýetleriniň ummanyň basseýnlerinde, çuň gatlaklarynda we wagtyň geçmegi bilen has giň ýaýramagyny üpjün etmek üçin girizildi.Bu maglumat bazalaryna (Goşmaça 1-nji tablisa we 1-nji surat) Tara okeanlarynda ýygnanan nusgalardan metagenomika (wirus bilen baýlaşdyrylan, n = 190; prokaryotik baýlaşdyrylan, n = 180) 12,22 we BioGEOTRACES ekspedisiýasy (n = 480) degişlidir.Gawaýi okean wagt seriýasy (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantik wagt seriýasy (BATS, n = 62) 21 we Malaspina ekspedisiýasy (n = 58) 23.Metagenomiki bölekleriň hemmesinden okalýan yzygiderlilik, adapterleri okamakdan aýyrmak, hil gözegçilik yzygiderliligine (PhiX genomlary) düzülen kartalary aýyrmak we trimq = 14, maq = 20 ulanmak bilen hil taýdan süzüldi, maxns = 0 we minlength = 45. Soňky derňewler görkezilen bolsa, QC okalmagy bilen birleşdirildi (bbmerge.sh minoverlap = 16).QC okalyşlary metaSPAdes (v.3.11.1 ýa-da zerur bolsa v.3.12) ulanmazdan ozal kadalaşdyryldy (bbnorm.sh target = 40, minddepth = 0).Alnan skafdan ýasalan gaplar (mundan beýläk skaflar diýilýär) ahyrsoňy uzynlygy (≥1 kb) süzüldi.
1038 metagenomiki nusgalar toparlara bölündi we nusgalaryň her topary üçin ähli nusgalaryň metagenomiki hiline gözegçilik okalyşy her nusganyň ýaýyna aýratyn gabat geldi, netijede iki sany goşa ýaýly topar okaldy: Tara Deňiz Wiruslary - Baýlandy (190 × 190), Prokaryotlar baýlaşdyryldy (180 × 180), BioGEOTRACES, HOT we BATS (610 × 610) we Malaspina (58 × 58).Kartalaşdyrmak Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188) 54 ulanylyp, okalyşyň ikinji sahypalara gabat gelmegine mümkinçilik berýär (-a baýdagyny ulanyp).Düzedişler azyndan 45 esas bolup, ≥97% şahsyýeti we ≥80% okalmagy üçin süzüldi.Alnan BAM faýllary, her topar üçin içerki we içerki gurşawy üpjün etmek üçin MetaBAT2 (v.2.12.1) 55 üçin jgi_summarize_bam_contig_depths skriptini ulanyp gaýtadan işlenildi.Ahyrynda, –minContig 2000 we –maxEdges 500 bilen ähli nusgalarda MetaBAT2 aýratynlykda işlemek arkaly duýgurlygy ýokarlandyrmak üçin ýaýlar toparlara bölünipdi. Garaşsyz synaglarda iň täsirli ýeke boksçy hökmünde görkezilendigi sebäpli, ansambl boksçysynyň ýerine MetaBAT2 ulanýarys.we beýleki köp ulanylýan boksçylardan 10-50 esse çalt57.Bollyk korrelýasiýalarynyň täsirini barlamak üçin tötänleýin saýlanan metagenomikanyň nusgasy (iki Tara ummany maglumat bazasynyň her biri üçin 10, BioGEOTRACES üçin 10, her gezek seriýa üçin 5 we Malaspina üçin 5) goşmaça nusga ulanyldy.Içerki nusgalar gurşaw maglumatlary almak üçin toparlara bölünýär.(Goşmaça maglumat).
Goşmaça (daşarky) genomlar indiki derňewlere, ýagny Tara Okeans26 maglumat bazasynyň bir böleginden el bilen saýlanan MAG-lary, GORG20 maglumat bazasyndan 5287 SAG we 1707 izolirlenen REF-den MAR maglumatlar bazasyndan (MarDB 4-nji aýat) we maglumatlar bazasyna girizildi. 682 SAG) 27. MarDB maglumat toplumy üçin, nusga görnüşi aşakdaky yzygiderli aňlatma gabat gelýän bolsa, genomlar elýeterli metadata esasynda saýlanýar: '[S | s ingle.? [C | c] ell | [C | c] ulture | [I | i] izolýasiýa edildi '.
Her metagenomiki gapyň we daşarky genomlaryň hili CheckM (v.1.0.13) we Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0) 58,59 ulanyp baha berildi.CheckM ýa-da Anvi'o ≥50% dolulygyna / dolulygyna we ≤10% hapalanma / artykmaçlyk barada habar berýän bolsa, soňraky derňew üçin metagenom öýjüklerini we daşarky genomlary tygşytlaň.Soňra bu ballar geniň hilini jemgyýetçilik kriteriýalaryna laýyklykda klassifikasiýa etmek üçin ortaça doly (mcpl) we orta hapalanma (mctn) birleşdirildi: ýokary hilli: mcpl ≥ 90% we mctn ≤ 5%;gowy hili: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, orta hil: mcpl ≥ 50% we mctn ≤ 10%, adalatly hil: mcpl ≤ 90% ýa-da mctn ≥ 10%.Süzülen genomlar soňra hil ballary (Q we Q ') bilen korrelýasiýa edildi: Q = mcpl - 5 x mctn Q' = mcpl - 5 x mctn + mctn x (dartyş üýtgeýşi) / 100 + 0.5 x log [N50].(dRep61-de amala aşyryldy).
Dürli maglumat çeşmeleri bilen genom görnüşleriniň (MAG, SAG we REF) arasyndaky deňeşdirme derňewine rugsat bermek üçin, dRep (v.2.5.4) ulanyp, genleriň ortaça nukleotid şahsyýetine (ANI) esaslanyp 34,799 genom kesgitlenildi.Gaýtalanýar) 61% 95 ANI çäkleri bilen 28,62 (-komp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0,2) we görnüşler derejesinde genleriň toparlanmagyny üpjün edýän SpecI63 ulanyp, bir gezeklik marker genleri.Görnüşleriň wekili hasaplanýan ýokarda kesgitlenen iň ýokary hil balyna (Q ') laýyklykda her dRep topary üçin wekilçilikli gen saýlandy.
Kartalaşdyryş tizligine baha bermek üçin BWA (v.0.7.17-r1188, -a) OMD-de bar bolan 34,799 genom bilen 1038 sany metagenomiki okalyşyň kartasyny kartalaşdyrmak üçin ulanyldy.Hil bilen dolandyrylýan okalanlar bir gezeklik re modeimde kartalaşdyryldy we netijede düzülen deňlemeler diňe ≥45 bp uzynlygy saklamak üçin süzüldi.şahsyýeti ≥95%.Her nusga üçin displeý gatnaşygy, hil gözegçiliginiň umumy sanyna bölünen süzgüçden soň galan okalýan göterimdir.Şol bir çemeleşmäni ulanyp, 1038 metagenomyň her biri 5 million goýma (giňeldilen maglumatlar, 1-nji surat) azaldyldy we OMD-de we ähli GEM16-da GORG SAG-a gabat geldi.GEM16 katalogynda deňiz suwlaryndan tapylan MAG-laryň mukdary, deňiz suwunyň nusgalaryny (mysal üçin, deňiz çökündilerinden tapawutlylykda) metagenomiki çeşmeleriň esasy sözleri bilen kesgitlenildi.Hususan-da, “suw” “ekosistema_ kategoriýa”, “deňiz” “ekosistema_ görnüşi”, “ýaşaýyş mekany” “çuň okean”, “deňiz”, “deňiz ummany”, “deňiz suwy”, “deňiz suwy” hökmünde saýlaýarys. “Okean”, “Deňiz suwy”, “faceerüsti deňiz suwy”, “faceerüsti deňiz suwy”.Netijede, 1823 OTU-dan gowrak paýlanan 5903 MAG (734 ýokary hilli) netijesi (şu ýere serediň).
Prokaryotik genomlar GTDB-Tk (v.1.0.2) 64 ulanyp, GTDB r89 wersiýasyny nyşana alýan deslapky parametrleri bilen taksonomik taýdan düşündirildi. Anvi'o domen çaklamasyna esaslanýan eukariotik genomlary kesgitlemek we ≥50% we artykmaçlyk ≤ 10% ýatlamak üçin ulanyldy.Bir görnüşiň taksonomik düşündirişi, onuň wekil genomlaryndan biri hökmünde kesgitlenýär.Eukariotlardan (148 MAG) başga, her gen ilki bilen prokka (v.1.14.5) 65 ulanyp, doly genleriň adyny tutup, zerur bolanda “arhaýa” ýa-da “bakteriýa” parametrlerini kesgitläp, iş ýüzünde düşündirildi. genleri kodlamak.we beýleki genom aýratynlyklarynyň arasynda CRISPR sebitleri.GetchMG (v.1.2) 66 ulanyp, ýeke-täk göçürme marker genlerini (uscMG) kesgitlemek bilen çak edilýän genleri belläň, ýumurtgaNOG (v.5.0) 68 esasynda emapper (v.2.0.1) 67 ulanyp ortolog toparlaryny belläň.KEGG maglumatlar bazasy (2020-nji ýylyň 10-njy fewralynda çap edildi) 69. Iň soňky ädim, DIAMOND (v.0.9.30) 70 ulanyp, beloklary KEGG maglumatlar bazasyna gabat getirmek bilen ýerine ýetirildi we sorag we mowzuk ≥70%.Netijeler, garaşylýan bitratyň iň ýokary ≥ 50% bitresi esasynda NCBI Prokaryotik Genom Annotasiýa Pipeline71 laýyklykda süzüldi.Gen yzygiderliligi, adaty parametrler we dürli toparlaýyn partlamalar bilen antiSMASH (v.5.1.0) 72 ulanyp, genomdaky BGC-leri kesgitlemek üçin giriş hökmünde ulanyldy.Genhli genomlar we düşündirişler webde bar bolan kontekst metadata bilen bilelikde OMD-de jemlendi (https://microbiomics.io/ocean/).
Öň beýan edilen usullara meňzeş 12,22, CD-HIT (v.4.8.1) toparyny> OMD-den bakterial we arheal genlerden 56,6 million belok kodlaýyş genini 95% şahsyýetine we gysga genlere (90% örtük) 73-e çenli ulandyk. > 17,7 million gen toparlary.Iň uzyn yzygiderlilik, her gen topary üçin wekilçilikli gen hökmünde saýlandy.Soňra 1038 metagenom> 17,7 million BWA (-a) klaster agzasyna gabat geldi we netijede BAM faýllary diňe ≥95% şahsyýet we ≥45 esasy deňlemeler bilen deňleşdirmeleri saklamak üçin süzüldi.Uzynlygy kadalaşdyrylan gen bollygy ilki bilen iň oňat deňleşdirmeden girizilen sanlary sanamak bilen, soň bolsa çylşyrymly kartalar üçin, özboluşly goşma sanyna proporsional degişli maksatly genlere fraksiýa sanlaryny goşmak bilen hasaplandy.
Giňeldilen OMD-den genomlar (“Ca. Eudormicrobiaceae” -den goşmaça MAG-lar bilen, aşakda serediň) MOTUs74 metagenomiki derňew gurallar bazasyna (v.2.5.1) giňeldilen MOTU maglumat bazasyny döretmek üçin goşuldy.On uscMG-den diňe alty sany göçürme genomy (23,528 genom) diri galdy.Maglumatlar bazasynyň giňelmegi görnüşler derejesinde 4,494 goşmaça topara sebäp boldy.1038 metagenom deslapky mOTU parametrleri bilen derňeldi (v.2).MOTU profilinde 644 mOTU toparyndaky (95% REF, 5% SAG we 99,9%) jemi 989 genom tapylmady.Bu MarDB genomlarynyň deňiz izolýasiýasynyň dürli goşmaça çeşmelerini görkezýär (kesgitlenmedik genomlaryň köpüsi çökündilerden, deňiz eýelerinden we ş.m. izolirlenen organizmler bilen baglanyşykly).Bu gözlegde açyk ummanyň gurşawyna ünsi jemlemegi dowam etdirmek üçin, bu işde döredilen giňeldilen MOTU maglumatlar bazasyna tapylmasa ýa-da goşulmasa, olary aşaky derňewden çykardyk.
OMD-daky MAG, SAG we REF-den ähli BGC-ler (ýokarda serediň) ähli metagenomiki skaflarda (antiSMASH v.5.0, deslapky parametrler) kesgitlenen BGC-ler bilen birleşdirildi we BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM domeni) 75 ulanylýar.Bu aýratynlyklara esaslanyp, BGC-leriň arasyndaky ähli kosin aralyklaryny hasapladyk we degişlilikde 0,2 we 0.8 aralyk çäklerini ulanyp, olary GCF we GCC-e toparladyk.Bu çäkler, ozal BiG-SLICE toparlanyş strategiýasyndaky käbir ýalňyşlygy ýeňilleşdirýän Ewklid aralygy 75 bilen kosin aralygy bilen bilelikde ulanylýan çäkleriň uýgunlaşmasydyr.
Soňra BGC-ler, öň beýan edilişi ýaly böleklere bölünmek töwekgelçiligini azaltmak we skaflarda kodlanan ≥5 kb saklamak üçin süzüldi we 1038 metagenomda ýok MarDB REF-lerini we SAG-laryny aýyrmak üçin (ýokarda serediň).Netijede, jemi 39 055 BGC OMD genomy bilen kodlanýar we metagenomiki böleklerde (ýagny MAG-lar bilen birleşdirilmedik) goşmaça 14106 kesgitlenildi.Bu “metagenomiki” BGC-ler, maglumatlar bazasynda alynmadyk deňiz mikrobiome biosintezi potensialynyň paýyna baha bermek üçin ulanyldy (Goşmaça maglumatlar).Her BGC anti-SMASH ýa-da BiG-SCAPE76-da kesgitlenen önüm önüm kategoriýalary bilen kesgitlenýän önümiň görnüşlerine görä işleýärdi.Her görnüş üçin diňe GCF üçin iň uzyn BGC saklamak bilen, mukdarda kesgitlemekde (GCC / GCF-iň taksonomiki we funksional düzümi, GCF we GCC-iň aralygy we GCF-iň metagenomiki bollygy) nusga almagyň öňüni almak üçin 39,055 BGC has köp neşir edildi, netijede jemi 17,689 BGC boldy.
GCC we GCF-iň täzeligi, hasaplanan maglumatlar binýadynyň (BiG-FAM-daky RefSeq maglumatlar bazasy) 29 we synagdan geçirilen (MIBIG 2.0) 30 BGC aralygyna baha berildi.17,689 wekil BGC-leriň her biri üçin degişli maglumatlar bazasyna iň kiçi kosin aralygy saýladyk.Bu iň az aralyklar, zerur bolanda GCF ýa-da GCC boýunça ortaça (ortaça).Maglumatlar bazasyna aralyk 0,2-den köp bolsa, GCF täze hasaplanýar, bu (ortaça) GCF bilen salgylanmanyň arasynda ideal bölünişige gabat gelýär.GCC üçin, baglanyşyklar bilen uzak möhletli gatnaşykda bolmak üçin, GCF tarapyndan kesgitlenen çäkden iki esse köp bolan 0.4-i saýlaýarys.
BGC-iň metagenomiki bollygy, gen derejeli profillerde bar bolan biosintetiki genleriniň (anti-SMASH tarapyndan kesgitlenişi ýaly) ortaça bollygy hasaplandy.Her GCF ýa-da GCC-iň metagenomiki bollygy soňra wekilçilikli BGC-leriň jemi hökmünde hasaplandy (17,689-dan).Bu bolçulyk kartalary, yzygiderli MOTU sanyny ulanyp, öýjükli kompozisiýa üçin kadalaşdyryldy, bu hem yzygiderli tagallalary hasaba aldy (giňeldilen maglumatlar, 1d surat).GCF ýa-da GCC-iň ýaýramagy, bollyk> 0 bilen nusgalaryň göterimi hökmünde hasaplandy.
Nusgalaryň arasyndaky ucewklid aralygy kadalaşdyrylan GCF profilinden hasaplandy.Bu aralyklar UMAP77 ulanyp kiçeldi we emele gelen goýmalar HDBSCAN78 ulanyp gözegçilik edilmedik dykyzlyga esaslanýan toparlara bölünmek üçin ulanyldy.HDBSCAN tarapyndan ulanylýan bir klaster üçin iň amatly bal sany (we şonuň üçin toparlaryň sany) klaster agzalygynyň jemleýji ähtimallygyny ýokarlandyrmak arkaly kesgitlenýär.Kesgitlenen klasterler (we üýtgeýşiň permutasiýa köpugurly derňewinde (PERMANOWA) ikitaraplaýynlygy hasaba almak üçin bu toparlaryň tötänleýin deňagramly nusgasy) PERMANOWA ulanyp bilimsiz ucewklid aralyklaryna garşy synag edildi.Nusgalaryň ortaça genom ölçegi MOTU-nyň otnositel köplügine we genleriň agzalarynyň çak edilýän gen ululygyna görä hasaplandy.Hususan-da, her mOTU-nyň ortaça gen ululygy (süzgüçden soň) düzedilen agzalarynyň gen ululyklarynyň ortaça mukdary hasaplandy (mysal üçin, 3 Mb uzynlygy 75% doly genomyň sazlanan ululygy 4) Mb).bitewiligi bolan orta genomlar üçin ≥70%.Her nusga üçin ortaça genom ululygy, degişlilikde bollyk bilen agramlanan mOTU genom ululyklarynyň jemi hökmünde hasaplandy.
OMD-de gen kodlanan BGC-leriň süzülen toplumy bakterial we arheal GTDB agaçlarynda (1038 metagenomda ýok REF we SAG MarDB-den başga, k5 kb çarçuwada, ýokarda serediň) we filogenetiki esasda çak edilýän önüm kategoriýalarynda görkezilýär. geniň ýagdaýy (ýokarda serediň).Ilki bilen bu görnüşdäki iň köp BGC genomy wekil hökmünde ulanyp, görnüşler boýunça maglumatlary azaltdyk.Wizuallaşdyrmak üçin wekiller hasam agaç toparlaryna bölündiler we ýene-de her öýjükli klada wekil hökmünde iň köp sanly BGC-ni öz içine alýan gen saýlandy.BGC bilen baýlaşdyrylan görnüşler (iň azyndan bir gen> 15 BGC bilen) şol BGC-lerde kodlanan önüm görnüşleri üçin Şannon dürlüligi indeksini hasaplamak arkaly hasam derňeldi.Çaklanylýan önümleriň görnüşleri birmeňzeş bolsa, himiki gibridler we beýleki çylşyrymly BGC-ler (anti-SMAH tarapyndan çak edilişi ýaly), topardaky tertibine garamazdan (meselem, belok-bakteriosin we bakteriosin-proteoprotein birleşmesi) şol bir önüm görnüşine degişlidir. beden).gibrid).
Malaspina nusgasy MP1648-den galan DNK (SAMN05421555) biologiki nusgasyna gabat gelýän we gysga okamak üçin Illumina SRR3962772 metagenomiki okalýan gabat gelýän, PacBio toplumy SMRTbell gDNA nusga güýçlendirijisini ulanmak üçin PacBio yzygiderlilik protokolyna laýyklykda işlenýär. toplum (100-980-000) we SMRTbell Express 2.0 şablon taýýarlaýyş toplumy (100-938-900).Gysgaça, galan DNK Covaris (g-TUBE, 52104) ulanyp kesildi, bejerildi we arassalandy (ProNex monjuklary).Arassalanan DNK, soňky arassalama ädiminden (ProNex monjuklary) we Sequel II platformasynda yzygiderlilige çenli kitaphana taýýarlanyşyna, güýçlendirilmegine, arassalanmagyna (ProNex monjuklary) we ululygynyň saýlanylmagyna (> 6 kb, Mawy Pippin) sezewar edilýär.
Ilkinji iki rekonstruksiýaMAG Eremiobacterota üçin başda hapalanma ballary esasynda süzülen alty sany goşmaça ANI> 99% kesgitledik (bular 3-nji surata girýär), soňra gen köpeltmesi hökmünde kesgitlenýär, aşaga serediň).Şeýle hem, “Ca” diýen ýazgyly tarelka tapdyk.Eremiobacterota ”dürli gözleglerden 23 we olary sekiz sany MAG bilen bilelikde ulanyp, BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - baýdak) ulanyp, 633 eukariotik baýlaşdyrylan (> 0.8 µm) nusgalardan metagenomiki okamak üçin salgylanma hökmünde ulandy. kartalaşdyrmak (5 million okalýar).Baýlaşdyrmaga mahsus kartalara esaslanyp (95% deňleşdiriş şahsyýeti we 80% okalýan örtük bilen süzülýär) 10 sany metagenom (garaşylýan örtük ≥5 ×) ýygnamak üçin we mazmun korrelýasiýasy üçin goşmaça 49 metagenom (garaşylýan örtük ≥1 ×) saýlandy.Aboveokardaky ýaly parametrleri ulanyp, bu nusgalar berkidildi we goşmaça 10 Ca goşuldy.MAG Eremiobacterota dikeldildi.Bu 16 MAG (maglumatlar bazasyndaky eýýäm ikisini hasaba almazdan) giňeldilen OMD-de genomlaryň umumy sanyny 34,815-e ýetirýär.MAG-lara genom meňzeşligine we GTDB-däki ýagdaýyna baglylykda taksonomiki derejeler berilýär.18 MAG bir maşgalada dRep ulanyp 5 görnüşe (kesgitli ANI> 99%) we 3 görnüşe (intrageneriki ANI 85% -den 94%) bölünip berildi79.Görnüşleriň wekilleri bitewilige, hapalanmaga we N50 esasynda el bilen saýlandy.Teklip edilýän nomenklatura goşmaça maglumatlarda berilýär.
'Ca' -nyň bitewiligine we hapalanmagyna baha beriň.MAG Eremiobacterota, uscMG-iň bardygyny, şeýle hem CheckM we Anvi'o tarapyndan ulanylýan nesil we domen aýratyn bir nusgalyk marker gen toplumyna baha berdik.40 uscMG-den 2 sany dublikatyň kesgitlenmegi, bolup biljek hapalanmagy aradan aýyrmak üçin filogenetik rekonstruksiýa bilen tassyklandy (aşakda serediň) (bu 40 marker geniniň esasynda 5% gabat gelýär).Bäş wekil MAGs Ca-nyň goşmaça gözlegleri.Bu durky täzelenen genomlardaky hapalaýjylaryň pes derejesi, köplük we yzygiderlilik kompozisiýalaryna esaslanýan interaktiw Anvi'o interfeýsini ulanyp, Eremiobacterota görnüşleri üçin tassyklandy (Goşmaça maglumatlar) 59.
Filogenomiki derňew üçin bäş sany “MA” MAG-ny saýladyk.Eudormicrobiaceae ”, ähli görnüşler“ Ca.Eremiobacterotanyň genomy we beýleki fitanyň agzalary (şol sanda UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Hloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria and Planctomycetota) GTDB (r89) 13-den elýeterlidir.Bu genomlaryň hemmesi, ýekeje göçürme marker genini çykarmak we BGC düşündirişi üçin öň düşündirilişi ýaly düşündirildi.GTDB genomlary ýokardaky bütewilik we hapalanma ölçeglerine laýyklykda saklandy.Filogenetiki derňew Anvi'o Phylogenetics59 iş akymynyň kömegi bilen geçirildi.Agaç, Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551) 81 tarapyndan kesgitlenen 39 tandem ribosomal beloklaryň deňleşdirilmegi üçin IQTREE (v.2.0.3) (deslapky görnüşler we -bb 1000) 80 ulanylyp guruldy.Iş orunlary azaldy.genomyň azyndan 50% -ini ýapmak üçin we Planctomycecota GTDB agaç topologiýasyna esaslanýan topar hökmünde ulanyldy.40 uscMG-den bir agaç şol bir gurallary we parametrleri ulanyp guruldy.
Umumy mikrob aýratynlyklaryny çaklamak üçin adaty parametrleri (fenotip, nukleotidlerden) Traitar (v.1.1.2) ulandyk.Genomdaky belok-kodlaýyş geniniň mazmunyna baglylykda ozal işlenip düzülen ýyrtyjy indeks 84 esasynda mümkin ýyrtyjy ýaşaýyş durmuşyny öwrendik.Hususan-da, genomdaky beloklary OrthoMCL maglumatlar bazasy (v.4) 85 bilen deňeşdirmek üçin “duýgur duýgur –id 25 – sorag-örtük 70” mowzuk örtügi 70 –top 20 we degişli genleri sanamak üçin ulanýarys. ýyrtyjylar we ýyrtyjy däller üçin marker genleri.Indeks, ýyrtyjy we ýyrtyjy däl bellikleriň sanynyň arasyndaky tapawut.Goşmaça gözegçilik hökmünde “Ca” genomyny hem analiz etdik.Entotheonella TSY118 faktory, Ca bilen baglanyşygyna esaslanýar.Eudoremikrobium (uly genomyň ululygy we biosintetiki potensialy).Ondan soň, ýyrtyjy we ýyrtyjy däl marker genleri bilen Ca-nyň biosintetiki potensialynyň arasyndaky baglanyşyklary barladyk.“Eudormicrobiaceae” we birden köp geniň (marker geniniň islendik görnüşinden, ýagny ýyrtyjy / ýyrtyjy däl geniň) BGC bilen gabat gelmeýändigini, bu BGC-nyň ýyrtyjy signallary bulaşdyrmaýandygyny görkezýär.Dykylan nusgalaryň goşmaça genom düşündirişi, sekresiýa ulgamyny, pili we flagella86-ny anyklamak üçin TXSSCAN (v.1.0.2) ulanylyp ýerine ýetirildi.
Bäş wekil 'Ca', Tara okeanlarynyň prokaryotik we eukariotik baýlaşdyryş fraksiýalaryndan 623 metatranscriptomy kartalaşdyrmak arkaly kartalaşdyryldy22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a baýdagy ulanyp).Eudormicrobiaceae genomy.BAM faýllary 80% okalandan soň we 95% şahsyýet süzgüçinden soň FeatureCounts (v.2.0.1) 88 bilen işlenip düzüldi gen üçin goýulýanlaryň sany.Döredilen kartalar gen uzynlygy we marker gen bollygy üçin kadalaşdyryldy (goýmak sanlary bilen genler üçin ortaça kadalaşdyrylan san) we her gen derejesiniň öýjügine degişlilikde aňlatma almak üçin 22,74-e üýtgedildi. yzygiderlilikde nusgadan nusga üýtgemegi.Şeýle gatnaşyklar deňeşdirip bolmaga mümkinçilik berýär, otnositel bolçulyk maglumatlary ulanylanda kompozisiýa meselelerini azaldýar.Genomyň ep-esli bölegini tapmaga mümkinçilik bermek üçin diňe 10 mOTU marker geniniň> 5-si bolan nusgalar göz öňünde tutuldy.
'Ca.E. taraoceanii UMAP ulanyp ölçeg ölçegleriniň peselmegine sezewar boldy we netijede aňlatma ýagdaýy kesgitlemek üçin HDBSCAN (ýokarda serediň) ulanyp gözegçilik edilmedik toparlara ulanyldy.PERMANOWA, asyl (azaldylmadyk) aralyk giňişliginde kesgitlenen toparlaryň arasyndaky tapawudyň ähmiýetini barlaýar.Bu şertleriň arasyndaky diferensial aňlatma geniň üstünde synag edildi (ýokarda serediň) we 201 KEGG ýoly 6 sany funksional toparda kesgitlenildi, ýagny: BGC, TXSSCAN-dan sekresiýa ulgamy we baýdak genleri, zaýalanýan fermentler (proteaz we peptidazalar), we ýyrtyjy we ýok ýyrtyjy genler.ýyrtyjy görkezijiler.Her bir nusga üçin, her synp üçin ortaça kadalaşdyrylan aňlatmany hasapladyk (BGC aňlatmasynyň özi BGC üçin biosintetiki genleriň ortaça aňlatmasy hökmünde hasaplanýandygyny belläň) we ştatlaryň arasynda ähmiýeti barlanyldy (FDR üçin düzülen Kruskal-Wallis synagy).
Sintetiki genler GenScript-den, PCR primerleri Microsynth-dan satyn alyndy.Termo Fisher Scientific-den Phusion polimeraza DNK güýçlendirmek üçin ulanyldy.DNK arassalamak üçin NucleoSpin plazmidleri, NucleoSpin jeli we Macherey-Nagel-den PCR arassalaýyş toplumy ulanyldy.Çäklendiriji fermentler we T4 DNK ligasy Täze Angliýa Biolabs-dan satyn alyndy.Izopropil-d-d-1-tiogalaktopyranozidden (IPTG) (Biosinth) we 1,4-ditiotreýtoldan (DTT, AppliChem) başga himiki maddalar Sigma-Aldrihden satyn alyndy we has arassalanmazdan ulanyldy.“AppliChem” -den antibiotik hloramfenikol (Cm), spektinomisin dihidroklorid (Sm), ampisillin (Amp), gentamisin (Gt) we karbenisillin (Cbn) satyn alyndy.Bacto Tryptone we Bacto Hamyr Extract media komponentleri BD Biosciences-den satyn alyndy.Yzygiderlilik üçin “Trypsin” “Promega” -dan satyn alyndy.
Gen yzygiderliligi çak edilýän BGC 75.1 anti-SMASH-dan alyndy.E. malaspinii (Goşmaça maglumat).
Genler embA (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gen_5), embM (lokus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) genleri, we EAM (intergen sebitleri goşmak bilen) pUC57-de sintetik konstruksiýalar hökmünde yzygiderlidi. haçan.EmbA geni, BAMHI we HindIII açyk ýerleri bolan pACYCDuet-1 (CmR) we pCDFDuet-1 (SmR) ilkinji köp klonlaşdyryş meýdançasyna (MCS1) bölünipdi.EmbM we embMopt genleri (kodon-optimallaşdyrylan) MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) BamHI we HindIII bilen bölünip, pCDFDuet-1 (SmR) we pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) bilen ikinji klonlaşdyryş meýdançasyna ýerleşdirildi. NdeI / ChoI.EmbAM kasetasy BamHI we HindIII açyk ýerleri bilen pCDFDuet1 (SmR) görnüşine bölünipdi.Efc3 / Emob (Goşmaça goşundy tablisa).6).Çäklendiriji ferment siňdiriş we baglamak öndürijiniň teswirnamasyna (New England Biolabs) ýerine ýetirildi.