310 10 * 1mm Poslamaýan polatdan örtülen turba himiki komponenti, Spidroiniň N terminaly domenleri amiloid fibrillere esaslanýan gidrogelleri emele getirýär we beloklaryň immobilizasiýasy üçin platforma döredýär.

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.

Spesifikasiýa

310 10 * 1mm Poslamaýan polatdan ýasalan turba üpjün edijileri

Himiki düzümi

Mehaniki aýratynlyklary

Rekombinant möý ýüpek beloklary (möý ýüpek beloklary) täze biomateriallary ösdürmekde köp mümkinçilige eýedir, ýöne olaryň multimodal we agregasiýa häsiýetli bolmagy olary almagy kynlaşdyrýar we ulanmagy aňsatlaşdyrýar.Bu ýerde rekombinant miniatýura spidroin beloklarynyň we iň esasysy N terminaly domeniň (NT) özi 37 ° C-de çalt goldaýan we aç-açan gidrogelleri emele getirýändigini habar berýäris.NT we ýaşyl floresan belogyndan ýa-da purin nukleozid fosforilazdan ybarat birleşme beloklary doly işleýän birleşme beloklaryny emele getirýär.Gidrogeller.Netijelerimiz, rekombinant NT we birleşýän beloklaryň ýokary aňlatma üpjün edýändigini we gidrogellere aç-açanlyk, biri-birine baglanyşyksyz jelasiýa we ýokary dykyzlykdaky işjeň beloklaryň göni immobilizasiýasy ýaly özüne çekiji häsiýetleri berýändigini görkezýär.
Öýjüklerde ýedi dürli ýüpek bezegi bar, olaryň hersi belli bir ýüpek öndürýär.Sevenedi ýüpek görnüşiniň hemmesi takmynan 6000 galyndydan ybarat möý ýüpek beloklaryndan (spidroinlerden) durýar we sferik N- we C terminaly domenler (NT we CT) 1,2 bilen gurşalan uly merkezi gaýtalanýan sebiti öz içine alýar.Iň köp öwrenilen ýüpek görnüşi, esasy ampula esasy ampula bezegi tarapyndan öndürilýär.Bu bezde epitel öýjükleriniň monolaýeri spidroin beloklaryny sintez edýär we beziň lýumenine bölüp çykarýar, olar gaty ýokary konsentrasiýalarda (30-50% w / v) 3,4 ereýän görnüşde (doping) bar.Bezdäki esasy ampullar spidroin beloklarynyň gurulmagy we üýtgemegi barada jedel edildi, ýöne synag synaglarynyň köpüsi umumy dik we / ýa-da tötänleýin dik öwrülişigiň we mikellar ýa-da lamellar gurluşlarynyň bardygyny görkezýär 5,6,7,8,9,10.Gaýtalanýan domenler ýüpek süýümleriniň mehaniki aýratynlyklaryny kadalaşdyryp, list sahypaly nanokristallary we amorf gurluşlary11,12,13,14,15 emele getirýän bolsa, ahyrky domenler ýüpek beziniň ugrundaky üýtgeýän şertlere jogap hökmünde ýüpek süýümlerini kadalaşdyrýar16,17,18.Küpek emele gelişine gözegçilik etmek bilen, 19. Terminal domenleri ewolýusiýa taýdan saklanýar we olaryň işi ähli spidroin beloklary üçin umumy bolup biler 2,20,21.Beziň içinden geçip barýarka, spidroiniň pH takmynan 7,6-dan <5.716-a çenli azalýar we kem-kemden daralýan kanalyň üsti bilen hereket etmek arkaly araçyllyk bilen uzalýar.Çözüwde, CT α-dikligine esaslandyryjy paralel dimer17, ýöne pes pH we gyrkyjy güýçlere jogap hökmünde, CT 16, 17-nji gatlaklary açýar we açýar, 16-njy öwrülişigiň gaýtalanýan sebitlerinde β gatlaklary döredip biler. NT monomerikdir beziň lýumenindäki şertleri görkezýän we spidroiniň erginligini ara alyp maslahatlaşýan şertler, ýöne pH peselende, birnäçe karboksil kislotasynyň gapdal zynjyrlarynyň protonasiýasy NT-nyň pKa bilen takmynan 6.5 pese gaçmagyna getirýär, şeýlelik bilen NT-ni durnuklaşdyrýar we spidroini düzýär. mukdary.torlar16,18.Şeýlelik bilen, NT filamentiň emele gelmeginde örtükdäki monomerden süýümdäki ölçege 23,24,25 üýtgäp, möhüm rol oýnaýar.NT 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29-a çenli öwrenilen ähli şertlerde ýokary erginli we dikligine galýar, bu bolsa heterologiki beloklaryň öndürilmegi üçin çözgüdi ýokarlandyrýan bellik hökmünde ösmegine itergi berdi.
Arassalamak üçin bir NT, bir gysga gaýtalanýan sebit, bir KT we His6 belliginden (His-NT2RepCT) ybarat rekombinant kiçi möý ýüpek belogy, ýerli möý ýüpek belogy ýaly suw buferinde ereýär we ýüpek möýüň ýerli möhüm aýratynlyklaryny meňzeýär. .gurşaw 25.31.Onuň-NT2RepCT, pH 525,32,33,34,35 suw wannasyna pH 8 ereýän örtük çykarylýan biomimetiki maşyn ulanyp, üznüksiz süýümlere aýlanyp bilner.His-NT2RepCT-ni aňladýan E. coliniň bioreaktor fermentasiýasy we soňraky bejergisi arassalanandan soň> 14 g / L hasyl berdi.Hisokary hasyllylygy, ýokary çözülişi we His-NT2RepCT-iň kislotaly şertlere ýeterlik jogap bermegi bularyň hemmesi NT23, 25, 34 bilen baglanyşykly.
Bu ýerde, rekombinant spidroin beloklaryndan, şol sanda diňe NT-den, 37 ° C-de bir belok erginini inkubasiýa etmek arkaly aç-açan gidrogelleriň çalt emele gelendigini habar berýäris.Tiýoflawin T floresan (ThT), Furyer infragyzyl spektroskopiýa (FTIR), ýadro magnit-rezonans spektroskopiýasy (NMR) we elektron mikroskopiýa (TEM) ulanyp, NT we mikrospider beloklarynyň strukturalara we amiloid ýaly fibrillere gurluş taýdan üýtgeýändigini gördük. jeller emele gelende.Mundan başga-da, NT-iň birleşýän beloklary we ýaşyl floresan belogy (GFP) ýa-da purin nukleozid fosforilaz (PNP), doly işleýän birleşme bölekleri bilen gidrogelleri emele getirýär.Geterologiki ýer eýelerinde ýokary geçiş aňlatmasy, fiziologiki şertlerde gidrogelleriň çalt emele gelmegi bilen in engineenerli funksiýalary bolan gidrogelleri tygşytly öndürmek mümkinçiligini açýar.
Has köp habar berilýän rekombinant spidroin beloklaryndan tapawutlylykda, His-NT2RepCT, Tris-HCl buferinde pH 8-de durnukly we ýagyş bolmazdan 500 mg / mL çenli jemlenip bilner25.Şol sebäpden, bu belogyň 37 ° C inkubasiýa edilende optiki taýdan aýdyň we öz-özüni goldaýan gidrogelleri çalt emele getirýändigine geň galdyk (1b-d surat).Geçirilen gözlegler, His-NT2RepCT jelasiýasynyň belok konsentrasiýalarynyň köpüsinde (10–300 mg / mL) ýüze çykandygyny we bu konsentrasiýanyň jelleşme wagty bilen ters arabaglanyşygyny görkezdi (1-nji surat we goşmaça surat 1).His-NT2RepCT ara gidrogel emele gelişiniň haýsy böleklerini bilmek üçin, her domeni aýratyn we dürli kombinasiýalarda çüýşe inwersiýa barlagyny ulanyp gözden geçirdik (1a surat, b).Rekombinant spidroiniň barlanylan fraksiýalary, 1R-den az wagtyň içinde emele gelen jelleri (300 mg / mL belok konsentrasiýasynda), 2Rep (1-nji surat) -dan başga.Bu, diňe NT we CT bilen bilelikde ýa-da gaýtalanmalar bilen bilelikde 37 ° C-de gelip biljekdigini we His6 belliginiň bu prosese ep-esli derejede täsir etmeýändigini görkezýär.NT-iň ýokary erginli we durnukly belokdygy we rekombinant spidroin gidrogelleriniň ozalky hasabatlarynda jelasiýa effektlerini gaýtalanýan sebitlerde we / ýa-da KT-lerdäki üýtgeşmeler bilen baglanyşdyrýandygy baradaky umumy düşünjäni göz öňünde tutup, NT-iň özi bolup biler.Jelasiýanyň tapylmagy garaşylmady.Goşmaça tablisa 1) 37, 38, 39. NTeri gelende aýtsak, NT eýýäm mg 300 mg / mL konsentrasiýasynda 10 minutyň içinde jellady (1-nji surat).NT-nyň dürli konsentrasiýalary bilen flakon inwersiýa synaglary> 50 mg / ml-de NT ergininiň degişli konsentrasiýada His-NT2RepCT-den has çalt çykýandygyny görkezdi (w / v, 1c surat).
Bu eserde öwrenilen dürli spidroin konstruksiýalarynyň shematiki görnüşi.b Geliň wagty 37 ° C-de, dürli rekombinant spidroin beloklary (300 mg / mL) flakony üýtgetmek arkaly barlanýar.KT jeli inkubasiýa bolmazdan derrew (<300 mg / mL), 2Rep çökündiler (300 mg / mL, 5 mm şkalada).c 37 ° C-de görkezilen belok konsentrasiýalarynda His-NT2RepCT we NT-iň gel wagty.d His-NT2RepCT we NT gidrogelleriniň möý bilen suratlary we aşagynda çap edilen “NT” harpy (ikisi hem 200 mg / mL, şkalasy 5 mm).
Dürli rekombinant spidroin beloklaryndan emele gelen gidrogeller birneme dürli reňklere eýe, ýalaňaç göz synlary dürli derejedäki aç-açanlygy görkezýär (1-nji surat).NT jelleri beýleki jeller düşnüksiz bolanda gaty düşnüklidir.Silindr turbalaryna zyňylan NT -R2CT we NT jelleri galyndydan aýrylyp bilner (1-nji surat).
Häzirki wagtda rekombinant spidroin beloklarynyň jelleşmegine sebäp bolýan tebigy möý ýüpek örtük jeliniň bardygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin, Şwesiýa köpri möýüniň (Larinioides sclopetarius) uly ampulla bezeginden örtükler ýygnaldy.Örtükler 20 mM Tris-HCl buferinde 50 mg / mL (ölçenen gury agram esasynda) saklandy, ýöne 37 ° C-de 21 günlük inkubasiýa wagtynda hiç hili jelasiýa bolmady (Goşmaça 2a surat).
Bu jelleri kesgitlemek üçin, geologiki prosesi öwrenmek we umumy mehaniki häsiýetleri kesgitlemek üçin reologiki ölçegler ulanylyp bilner.Hususan-da, ýokary temperaturada saklaýyş modulyna (elastikligine) gözegçilik etmek, örtügiň temperaturasy we örtügiň viskoelastik aýratynlyklary barada maglumat berip biler.Temperaturanyň ýokarlanmagy synaglary (tebigy ýüpek ätiýaçlyk erginlerini ulanmak bilen geçirilen öňki gözlegleriň esasynda 25-45 ° C-de 1 ° C / min ulanmak) 40,41, His-NT2RepCT we NT erginleriniň saklaýyş modulynyň temperaturanyň ýokarlanmagy bilen ýokarlanandygyny görkezdi.ýokarlandyryldy (2-nji surat we goşmaça 3-nji surat).NTeri gelende aýtsak, NT moduly His-NT2RepCT bilen deňeşdirilende has pes temperaturada ösüp başlady, NT-iň His-NT2RepCT bilen 37 ° C-de göni inkubasiýa edilende görlen has çalt gel wagtyna laýyk gelýär (1-nji surat).Temperaturanyň soňraky peselmeginden soň, saklaýyş moduly pes bahalara gaýdyp gelmedi we termiki yzyna gaýtaryp bolmajak durnukly jelasiýany görkezýän ýitgi modulynyň üstünde galdy (Goşmaça 3-nji surata serediň).Jelasiýadan soň, iň soňky elastik modul 100-500 mg / ml konsentrasiýasynda His-NT2RepCT gidrogelleri üçin 15 bilen 330 kPa aralygynda, NT gidrogelleri üçin iň soňky elastik modul (100-500 mg / mL) 2 bilen 1400 aralygyndady. kPa (2-nji surat we doly maglumat) goşmaça 3-nji surata serediň).
His-NT2RepCT (300 mg / mL) we b NT (300 mg / mL) titremesi bilen temperaturanyň üýtgemegi.Oklar temperaturanyň tendensiýasyny görkezýär, saklaýyş modulynyň maglumatlarynyň has ýeňil kölegesi, sesiň ýokarlanmagynyň sebäbi bolan öndüriji tarapyndan görkezileninden has pes tork bahalarynda synaglary görkezýär.c Hisokary temperaturadan (100, 300, we 500 mg / mL) His-NT2RepCT we NT-iň ahyrky modul toplanmagy.Modhli modul okaýyşlary 0,1 Hz ýygylykda alynýar.
Jelasiýa bilen baglanyşykly sazlaşykly üýtgeşmeleri derňemek üçin potensial usul hökmünde, 37 ° C-den gelasiýadan öň we soň His-NT2RepCT we NT FTIR spektrini ýazga geçirdik (3a surat, b).Garaşylyşy ýaly, His-NT2RepCT we NT çözgütleriniň spektri α-gelix / tötänleýin rulon ikinji derejeli gurluşyny görkezýän beloklara gabat gelýär, aýdylyşy 1645 sm-1.Iki gidrogel üçin jelasiýa, takmynan 1617 sm-1 we 1695 sm-1 (3-nji surat, b) orta zolakda iki goluň emele gelmegine sebäp boldy, bu bolsa antiparallel list listleriň emele gelendigini görkezýär.Bu üýtgeşmeleri degişli ikinji emele gelen we tapawut jelýasiýa spektrinde-de aýdyň görmek bolýar (Goşmaça 4b surat).NT β gatlagynyň iki zolagy, His-NT2RepCT-den has aýdyňdy, bu bolsa NT gidrogelindäki β gatlak zolaklarynyň umumy mazmunynyň NT2RepCT gidrogelinden has ýokarydygyny görkezýär.
His-NT2RepCT we b NT (ikisi hem 500 mg / mL) FTIR siňdiriş spektri (ergin) we 37 ° C-den soň (gel) inkubasiýa edilenden soň.c TEM şekilleri 50 mg / ml NT2RepCT jelleri we d NT şekilleri.Tereziniň çyzgysy 200 nm.e His-NT2RepCT we NT gidrogelleriniň süýüm diametrleri.n = 100 ölçenen fibril, p <0.0001.Erroralňyşlyk setirleri adaty gyşarmany görkezýär.Erroralňyşlyk panelleriniň merkezi ortaça.Statistik derňew üçin jübütlenmedik t-synag (iki guýrukly) ulanyldy.f Dürli rekombinant spidroin beloklarynyň (100 mg / mL) 37 ° C-de titremezden floresanlygy.g NT (100 mg / mL) 100 mg / mL NT jelinden 0%, 5%, 10% we 20% tohum bilen sanjym synaglary.
Geçiriş elektron mikroskopiýasy (TEM) arkaly jeliň seljermesi gidrogeliň amiloid görnüşli fibrillerden ybaratdygyny görkezdi (3c, 3d suratlar).NT-dan emele gelen süýümler uzaldyldy (diametri 5–12 nm) we şahasy ýok, His-NT2RepCT süýümleriniň uzynlygy has gysga we diametri ep-esli giňdi (7-16 nm) (3e surat).Bu netijeler, tioflawin T (ThT) barlagyny ulanyp, fibrozyň kinetikasyny yzarlamaga mümkinçilik berdi.Rekombinant spidroin beloklarynyň hemmesi üçin nusgalar 37 ° C-de inkubasiýa edilende floresan signal ýokarlandy (3-nji surat, goşmaça 5a surat).Bu tapyndy bilen yzygiderli, NT we His-NT2RepCT-iň mikroskopiki gözden geçirilmegi, ThT-pozitiw agregatlaryň ep-esli toplanmazdan ThT floresanlygynyň birmeňzeş ýokarlanandygyny ýüze çykardy (Goşmaça 5b, c).ThT-polo positiveitel fibrilleriň emele gelmegi NT we His-NTCT bulaşyklygynyň ýokarlanmagy bilen utgaşmady (Goşmaça 5d surat), bu jeldäki fibrilleriň ulgamynyň gel aýdyňlygyna zyýan bermezden emele gelip biljekdigini aňladýar.Öň emele gelen süýümleri az mukdarda goşmak bilen ekmek, käbir amiloidleriň fibril emele gelmegini ep-esli çaltlaşdyryp biler, ýöne NT gidrokagulantlarynyň erginine 5%, 10% ýa-da 20% (w / w) NT goşup biler.ekiş täsiri (3g surat).Perhapshtimal, munuň sebäbi gidrogeldäki süýümleriň birneme durnuklydygy we tohum hökmünde ulanylyp bilinmeýändigi bilen baglanyşyklydyr.
Highokary temperaturada rekombinant spidroin beloklarynyň garaşylmadyk hereketi, geliň emele gelmegi bilen baglanyşykly üýtgeşmeleri kesgitlemek üçin ýadro magnit-rezonans (NMR) spektroskopiýa barlaglaryna itergi berdi.37 ° C-de wagtyň geçmegi bilen ýazylan His-NT2RepCT çözgütleriniň NMR spektri, KT henizem bölekleýin bukulandygyny görkezdi, NT we 2Rep signallary ýitdi (4a surat), esasan, NT we 2Rep, His-iň emele gelmegine bölekleýin gözegçilik edýändigini görkezýär. NT2RepCT gidrogel.KT signaly, asyl intensiwliginiň 20% -ine deňleşdirilip, KT-nyň esasan durnuklydygyny we gidrogel gurluşyna goşulandygyny görkezýär.Öňünden goýlan nusgadaky ýaly ykjam we şeýlelik bilen NMR çözgüdi bilen syn edilýän KT-iň kiçi bölegi üçin spektrlerde ilkinji 10 gurluşly galyndy üçin signal ýok, belki-de His-NT2Rep-iň birikdirilen böleginiň kyn immobilizasiýasy sebäpli.Gidrogelleriň -NT2RepCT döwletiniň NMR spektri α helelleriň we β gatlaklaryň agdyklyk edýändigini we az derejede tötänleýin rulon öwrülişigini ýüze çykardy (4b surat).Diňe NT-de bar bolan metioniniň galyndylarynyň himiki çalşygy seljermesi bu domeniň sahypanyň gurluşyna öwrülendigini görkezdi.NT çözgüdi wagtlaýyn garaşly spektr, signalyň intensiwliginiň birmeňzeş peselmegini görkezdi (4c-nji surat), NT gidrogelleriniň gaty berk NMR NT galyndylarynyň köpüsiniň list gurluşlaryna öwrülendigini görkezdi (4d-nji surat).2Rep-iň konfigurasiýasyny jemlemek meýli sebäpli aýratyn kesgitläp bolmady.Şeýle-de bolsa, NTCT we His-NT2RepCT gidrogelleriniň berk NMR spektri gaty meňzeýärdi (4b surat; goşmaça 6b surat), 2Rep-iň His-NT2RepCT gidrogeliniň gurluş bölegine az goşant goşandygyny görkezýär.KT gidrogelleri üçin α heleller, β listler we tötänleýin dikligine ikinji derejeli gurluşlar bar (Goşmaça 6d surat).Bu, KT-iň käbir bölekleriniň “helel” bolup galýandygyny, beýlekisiniň bolsa “petek” bolandygyny görkezýär.Şeýlelik bilen, NMR spektroskopiýanyň netijeleri NT-iň gidrogeliň emele gelmegi üçin möhümdigini we 2Rep we CT bilen birleşenden soň sahypanyň görnüşine öwrülýändigini görkezýär.Şunuň bilen birlikde, amiloid giňişlikli fermuarlaryň NT domeniniň bäş gabygynyň hemmesinde emele gelýändigini gördük we Wals algoritmi 1-nji gelixde amiloidogen sebiti çaklady (4e surat).
2D spektrli 15N-HSQC 10 mg / mL His-NT2RepCT ergini (gök) we inkubasiýa (gyzyl) 37 sagatda 19 sagat soň.Gyzyl spektrdäki aýratyn çyzyklar we gök spektrdäki F24, G136, polyA bir harp aminokislotanyň nyşanlary we galyndy belgileri bilen görkezilýär.Salgylar, NT, 2Rep we CT domenlerinden saýlanan galyndylar üçin signalyň intensiwliginiň wagtyna baglylygyny görkezýär.b His-NT2RepCT gidrogelleriniň gaty ýagdaýdaky radioýygylyk (RFDR) spektri.RFDR spektrinde görlen Cα / Cβ galyndylarynyň arabaglanyşygy, peptid himiki üýtgemeleri we statistika82,83 we olaryň ikinji derejeli gurluşlaryndan alnan bahalar bilen deňeşdirilende kesgitlenildi.SSB - aýlanýan gapdal zolak.c 15N-HSQC 10 mg / mL NT ergininiň bir ölçegli spektri, 37 ° C-de 36 sagatlap inkubasiýa wagtynda.Goşundy, wagt bilen deňeşdirilende göwrümli intensiwligi görkezýär.d NT gidrogelleriniň gaty RFDR spektri.Cα / Cβ galyndylarynyň we RFDR spektrinde syn edilýän ikinji derejeli gurluşlaryň arabaglanyşygy görkezilýär.e Zipper maglumatlar bazasyndan (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 fibrilýasiýa ähtimallygy profiline esaslanýar.Geksapeptidiň giňişlikdäki ýyldyrym çalşygy penjiresiniň Rosetta energiýasy kkal / molda görkezilýär.Gyzyl barlar ýokary fibroz tizligi bolan heksapeptidleri aňladýar (Rosetta energiýasy -23 kkal / mol; punktir çyzygyň aşagynda).Greenaşyl barlar, Rosetta energiýasy bilen bosagadan ýokary bölekleri görkezýär we şonuň üçin steriki fermuarlary emele getirmek ähtimallygy az.Prolini öz içine alýan bölekler derňewden aýryldy (sütünsiz).Kwadratlar Waltz algoritmi81 (https://waltz.switchlab.org) tarapyndan çak edilýän amiloidozyň ýerlerini görkezýär.NT-nyň aminokislotanyň galyndylarynyň yzygiderliligi ýokarda, β ikinji derejeli gurluşda (gaty berk NMR spektroskopiýasy bilen kesgitlenýär) galyndylaryň görnüşleri gyzyl reňkde görkezilýär.Bäş NT hel-heleliň ýagdaýy (H1-H5) 28 hökmünde bellendi.
PH <6.5-de, HT ýylylyga ýa-da karbamid bilen örtülen denaturasiýa çydamly bolýar.NT dimerizasiýasynyň we durnuklylygynyň jelleşige nähili täsir edýändigini düşündirmek üçin 100 mg / ml NT bolan erginler, flakon inversiýa synagyndan peýdalanyp pH 8, 7 we 6-da gözegçilik edildi.PH 8 we 7-de inkubasiýa edilen NT nusgalary 30 minutdan 37 ° C-den geçdi, ýöne pH 8 jeli düşnükli boldy, pH 7 jeli görünýän çökgünligi görkezdi (5a surat).Munuň tersine, pH 6-da HT bolan ergin jel emele getirmedi we 37 ° C-den 20 minutdan soň uly çökgünlik görünýärdi.Bu, monomerler bilen deňeşdirilende özleriniň we / ýa-da has ýokary durnuklylygynyň jelasiýanyň öňüni alýandygyny görkezýär.NT 7 üçin pH 7 we 6-da çökgünligiň emele gelmegine garaşylmady, sebäbi NT-nyň 200 mg / ml27-de eräp biljekdigi, ýylylyk denaturasiýasyndan soň aňsatlyk bilen gaýtalanýandygy we pes bahalarynda α-gelix saklanýandygy habar berildi. pH 18. Bu gapma-garşylyklar üçin ähtimal düşündiriş, ozal habar berlen synaglaryň otag temperaturasynda ýa-da ondan aşakda ýa-da beloklaryň az konsentrasiýasynda16,18,19 bolmagydyr.
37 ° C inkubasiýa edilenden soň pH 8, 7, 6 we 154 mM NaCl (pH 8) -de NT flakon inversiýa synagy (100 mg / mL).b NT CD spektri degişlilikde 154 mM NaF we 154 mM NaCl bilen.222 nm aralykdaky elliptiklik tebigy epleriň paýyna öwrülýär.c NT öwrüliş barlagy (100 mg / mL) NT * (37 ° C we 60 ° C), NTA72R (37 ° C) we His-NT-L6 (37 ° C we 60 ° C).d NT mutantlarynyň CD spektri NT *, NTA72R we His-NT-L6.222 nm aralykdaky elliptiklik tebigy epleriň paýyna öwrülýär.e NTFlSp, NTMiSp inversiýa synagy we NTMiSp (100 mg / mL) peseldi.Tereziniň çyzgysy 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp CD spektrleri we NTMiSp azaldy.222 nm aralykdaky elliptiklik tebigy epleriň paýyna öwrülýär.25 ° C we 95 ° C-de doly NT spektrleri Goşmaça 8-nji suratda görkezilýär.
Fiziologiki duz konsentrasiýasy, NT subunitleriniň arasyndaky elektrostatik täsirleri we pes pH18-e NT geçirişiniň dimerizasiýasyny kesgitleýär.154 mM NaCl we NaF-iň bolmagy, degişlilikde jelasiýany saklaýandygyny (5a surat, b; goşmaça 2b surat) we bu duzlaryň NT monomerleriniň ýylylyk durnuklylygyny ýokarlandyrandygyny gördük (5b surat, goşmaça 8-nji surat). .Şeýle hem, dimerizasiýa däl-de, durnuklylygy ýokarlandyrmagyň jeliň emele gelmeginiň öňüni alýandygyny görkezýär.
Beloklaryň dimerizasiýasynyň we jelasiýadaky durnuklylygyň roluny has giňişleýin öwrenmek üçin, pes pH28.30 derejesinde monomer bolup galýan iki mutant, NT * we NTA72R ulandyk.NT *, monomeriň görünýän dipolýar zarýad paýlanyşynyň tekizlenýän goşa zarýad tersine mutant bolup, dimerizasiýanyň öňüni alýar we monomeriň durnuklylygyny düýpgöter ýokarlandyrýar.NTA72R zarýadly dipol, ýöne Arg bilen çalşylýan Ala has çäkli araçäkde ýerleşýär, şonuň üçin mutasiýa dimerizasiýa üçin zerur subunit täsirlerine päsgel berýär.37 ° C inkubasiýa edilenden soň, NT * gidrogel emele getirmedi, NTA72R bolsa 15 minut üçin açyk jel emele getirdi (5c-nji surat).NT * we NTA72R ikisi hem ölçäp bilmeýär, ýöne monomer durnuklylygy bilen tapawutlanýar (5d-nji surat), bu netijeler ýokary termodinamiki durnuklylygyň NT-iň döremeginiň öňüni alýandygyny görkezýär.Şeýle hem, HT * ýokary temperaturada durnuksyz bolanda jel emele getirýär (60 ° C-de 8 minutdan soň; 5c-nji surat).NT-de metioniniň köp mukdarynyň tebigy gatlagyny suwuklandyrýandygy we alty Met-Leu çalşygynyň (bu ýerde His-NT-L6 diýilýär) NT46 monomerini berk durnuklaşdyrýandygy öňem görkezildi.NT geliniň emele gelmegi üçin gurluş çeýeligi talap edilýär diýen çaklama esaslanyp, His-NT-L6 durnukly mutantyň 37 ° C-de gelmändigini gördük (5c surat, d).Şeýle-de bolsa, His-NT-L6 60 minutda 60 minut inkubasiýa edilende jel emele getirdi (5-nji surat).
NT-iň list gurluşlaryna öwrülmegi we gidrogelleri emele getirmek ukyby, spidroiniň NT domenleriniň käbirine degişlidir.Dürli ýüpek görnüşlerinden we möý görnüşlerinden bolan NT-ler, Trihonephila klawipleri (NTFlSp), metioniniň mukdaryna we ýokary ýylylyk durnuklylygyna garamazdan jelleri emele getirdi (5e-nji surat, f we goşmaça tablisa 2).Munuň tersine, pes ýylylyk durnuklylygy we ýokary metionin düzümi bolan Araneus ventricosus-dan (NTMiSp) kiçi ampullar belok spidroinden NT gidrogelleri emele getirmedi (Goşmaça tablisa 2 we 5e surat, f).Ikinjisi, öýjükli disulfid baglanyşyklarynyň bolmagy bilen baglanyşykly bolup biler29,47.NTMiSp-iň disulfid baglanyşyklary azalanda, 37 ° C-de 10 minut inkubasiýa edilenden soň gidrogel emele geldi (5e-nji surat).Sözümiň ahyrynda, gurluş çeýeliginiň NT-den jel emele gelmeginiň möhüm, ýöne ýeke-täk kriteriýadygyny bellemelidiris.Möhüm bolup biläýjek başga bir faktor, amiloid süýümleri emele getirmek ähtimallygydyr we fermuar maglumatlar bazasy we Wals algoritmi bilen seljerme jel emele getirmek ukyby bilen amiloidogen sebitleriň bolmagy, şeýle hem çak edilýän sebitleriň derejesi bilen arabaglanyşygy görkezdi. steriki fermuarlary emele getirmek.Korrelýasiýa bardy (Goşmaça 2-nji tablisa we goşmaça 9-njy surat).
NT-nyň fibrilleri emele getirmek we amatly şertlerde jel emele getirmek ukyby, beýleki belok bölekleri bilen NT birleşmeleriniň birleşmek hyzmatdaşlarynyň doly funksiýasy bilen jelleri emele getirip biljekdigini çaklamaga sebäp boldy.Muny barlamak üçin, degişlilikde NT-nyň C terminalynda ýaşyl floresan belogy (GFP) we purin nukleozid fosforilaz (PNP) hödürledik.Alnan birleşme beloklary, görkezilenlere laýyk gelýän iň ýokary hasyllylygy (degişlilikde 150-mg / L we His-NT-GFP we His-NT-PNP üçin 256 mg / L silkme medeniýeti) E. coli-de aňladyldy. NT Ref-e birleşdirilen beýleki beloklar üçin.30. His-NT-GFP (300mg / mL) we His-NT-PNP (100mg / mL) birleşme beloklary 37 ° C-de 2 sagat 6,5 sagatdan soň jel emele getirdi we iň möhümi, GFP fraksiýasy üýtgemedi.jelasiýadan soň syn edilýär, ilkibaşdaky floresan intensiwliginiň 70% -i gelasiýadan soň galypdyr (6a surat).PNP işjeňligini onuň-NT-PNP erginlerinde we jellerinde ölçemek üçin, birleşýän belogy NT bilen eritmeli bolduk, sebäbi arassa taýýarlygyň ferment işjeňligi jel konsentrasiýalarynda barlagyň çäginden daşdady.0.01 mg / mL His-NT-PNP we 100 mg / mL NT garyndysy bilen emele gelen jel, prekubirlenen nusgalaryň başlangyç ferment işjeňliginiň 65% -ini saklady (6b surat).Ölçeg wagtynda jel üýtgemedi (Goşmaça 10-njy surat).
His-NT-GFP (300 mg / mL) jelleşmezden öň we soň we görünýän we UV ýagtylygynda His-NT-GFP gidrogelini (300 mg / mL) öz içine alýan ters flakon.Ballar aýratyn ölçegleri görkezýär (n = 3), ýalňyşlyk setirleri standart gyşarmany görkezýär.Ortaça baha säwlik setirleriniň merkezinde görkezilýär.b PNP işjeňligi, NT (100 mg / ml) we 0,01 mg / ml-NT-PNP we 100 mg / ml Täze Taýwan dollaryndan ybarat erginleri we jelleri ulanmak arkaly florometrik derňew arkaly alyndy.Salgyda, His-NT-PNP (5 mm şkalada) bar bolan gidrogel bar bolan ters çüýşäni görkezýär.
Bu ýerde, NT-den we beýleki rekombinant spidroin beloklaryndan gidrogelleriň emele gelendigini habar berýäris (37-nji surat).Jelasiýanyň α-helelleriň β gatlaklara öwrülmegi we amiloid ýaly fibrilleriň emele gelmegi bilen baglanyşyklydygyny görkezýäris (3-nji we 4-nji suratlar).Bu tapyndy geň galdyryjy, sebäbi NT-ler gaty ýokary erginliligi we konsentrasiýalarynda ýokary durnuklylygy> 200 mg / mL-den birnäçe günüň dowamynda 4 ° C derejesinde belli bolan globusly bäş gelix paketleri bilen örtülendir27.Mundan başga-da, NT-ler az protein konsentrasiýalarynda ýylylyk denaturasiýasyndan soň NT-ler aňsatlyk bilen gaýdýarlar.Netijelerimize görä, fibril emele gelmegi> 10 mg / mL belok konsentrasiýasynyň we birneme ýokarlanan temperaturanyň birleşmegini talap edýär (1-nji surat).Bu, amiloid fibrilleriň fiziologiki şertlerde ýylylyk üýtgemeleri sebäpli bölekleýin açylmadyk ýagdaýda global derejede bukulan beloklardan emele gelip biljekdigi baradaky pikire laýyk gelýär.Bu öwrülişikden geçýän beloklara mysal hökmünde insulin 49,50, β2-mikroglobulin, transtiretin we lizozim 51,52,53 degişlidir.NT dogduk mekanynda he-gelix bolsa-da, polipeptid zynjyrynyň takmynan 65% -i steriki fermuar emele gelişine laýyk gelýär (4e surat) 45.Monomer dinamiki hereketli bolansoň, amiloidogen sebitleri ortaça ýokary temperaturada we umumy belogyň ýokary konsentrasiýalarynda amiloid fibril emele gelmegi üçin möhüm konsentrasiýa ýetip biler54.Bu pikirlenmeden soň, spidroiniň konsentrasiýasy bilen jelasiýa wagtynyň arasynda negatiw arabaglanyşygy tapdyk (1-nji surat), we monomeriki NT konfigurasiýasy mutasiýa (NT *, His-NT-L6) ýa-da duz goşmak arkaly durnuklaşdyrylan bolsa, munuň öňüni alyp biler. emele getirýän gidrogeller (5-nji surat).
Köplenç ýagdaýda amiloid fibriller çökgünlik ýaly erginden ýitýär, ýöne käbir şertlerde gidrogelleri 55,56,57 emele getirip biler.Gidrogel emele getirýän süýümler, adatça ýokary tarapa eýe bolup, molekulýar gurşaw arkaly durnukly üç ölçegli torlary emele getirýär, netijelerimize laýyk 55,58.Witroda gidrogel emele gelmegi üçin beloklar köplenç doly ýa-da bölekleýin açylýar, mysal üçin, organiki erginlere, ýokary temperatura (70–90 ° C) we / ýa-da pes pH (1.5–3.0) 59,60,61,62.Bu ýerde beýan edilen spidroin gidrogelleri gaty gaýtadan işlemegi talap etmeýär, ýa-da gidrogelleri durnuklaşdyrmak üçin birleşdiriji serişdeleri talap etmeýär.
Öň ýüpek egirilende spidroiniň gaýtalanmagy we QD-leriň gidrogel emele getirýändigi habar berildi.Gözleglerimiz bilen deňeşdirilende, inkubasiýa wagty we / ýa-da inkubasiýa temperaturasy degişlilikde has uzyn ýa-da has ýokarydy we emele gelen gidrogeller köplenç aç-açan däldi (7-nji surat we goşmaça tablisa) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ) we kollagen.(0.6%) (7-nji surat we 1-nji we 3-nji goşmaça tablisalar) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Bu gözlegde gidrogelleriň jel wagty we elastik moduly beýleki spidroin esasly gidrogeller we saýlanan tebigy gidrogeller bilen deňeşdirildi.Jyns şertleriniň beýany bilen birlikde salgylanmalar berilýär.APS Ammiak persulfat, otag temperaturasy.37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74-nji maglumatlar.
Öýjükler saklanylanda spidroiniň döremeginiň öňüni almagyň usullaryny oýlap tapana meňzeýär.Küpek bezeginde beloklaryň köp konsentrasiýasyna garamazdan, terminal domeni bilen baglanyşykly uly gaýtalanýan sebit, bu gözlegiň çäginde NT we KT-nyň göze görünýän konsentrasiýasynyň takmynan 10-20 mg / ml deňdigini aňladýar.in vitro gözegçilik edilýän gidrogeliň emele gelmegi üçin zerur.Mundan başga-da, 16 sany duzuň konsentrasiýasy ýüpek bezlerindäki ýaly NT-ni durnuklaşdyrdy (5b-nji surat).NT öwrülişi E. coli sitosolda öwrenildi we vitroda gözden geçirilenden has berk eplendi, bu duzuň ýa-da beýleki faktorlaryň wivo-da jemlenmeginiň öňüni alýandygyny görkezýär.Şeýle-de bolsa, NT-leriň list fibrillere öwrülmegi filamentiň emele gelmegi üçin möhüm bolup biler we geljekki gözleglerde derňelmelidir.
Bu gözlegde syn edilen NT-amiloid ýaly fibril we gidrogel emele gelişiniň täze taraplaryndan başga-da, bu hadysanyň biotehnologiki we biomedikal amaly bolup biljekdigini görkezýäris (8-nji surat).Düşünjäniň subutnamasy hökmünde NT-ni GFP ýa-da PNP bilen birleşdirdik we birleşýän belogyň 37 ° C inkubasiýa edilende gidrogelleri emele getirýändigini we GFP we PNP fraksiýalarynyň jelasiýadan soň işjeňligini saklaýandyklaryny görkezdik (6-njy surat).Nukleosid fosforilazlar, nukleozid analoglarynyň möhüm katalizator sintezi bolup, bu açyşymyzy biofarmasewtika pudagy üçin möhüm edýär.Amatly şertlerde aç-açan gidrogelleri emele getirýän birleşýän beloklary aňlatmak düşünjesi, ferment immobilizasiýasy, gözegçilik edilýän neşe serişdeleriniň goýberilmegi we dokuma in engineeringenerçiligi ýaly köp sanly amaly amatly amatly gidrogelleri döretmäge mümkinçilik berýär.Mundan başga-da, NT we NT * täsirli aňlatma bellikleri30, bu bolsa NT we onuň görnüşleriniň erän birleşýän beloklary ýokary öndürijilikli öndürmek we soňra 3D gidrogellerde hereketsiz maksatly beloklary döretmek üçin ulanylyp bilinjekdigini aňladýar.
NT erginli, hel-dik we pes konsentrasiýalarda (µM) we 37 ° C-de durnukly.Şol bir temperaturada, ýöne artýan konsentrasiýalarda (> 10 mg / ml), NT amiloid ýaly süýümlerden ybarat jelleri emele getirýär.NT birleşme beloklary, şeýle hem doly işleýän birleşme bölekleri bolan fibrillar jellerini emele getirýär, dürli beloklary NT ulanyp 3D gidrogellerde hereketsizleşdirmäge mümkinçilik berýär.Aşakda: NT (PDB: 4FBS) we süýüm torlarynyň we baglanyşykly belok gurluşlarynyň suratlary (çak edilýär we göwrümine çekilmeýär, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ2 / pdb).
Gurluşyklar (aminokislotalar yzygiderliligini goşmak bilen doly sanaw üçin goşmaça 4-nji tablisa serediň) plazma pT7-e klonlaşdyryldy we E. coli BL21 (DE3) görnüşine öwrüldi.Ineredenerli plazmidleri öz içine alýan E. coli kanamisin (70 mg / l) bilen doldurylan Luria çorbasyna sanjym edildi we bir gije 30 ° C we 250 aýlawda ulaldy.Soňra medeniýet, kanamisini öz içine alýan LB gurşawyna 1/100 sanjym edildi we OD600 0.8-e ýetýänçä 30 ° C we 110 aýlawda ösdürilip ýetişdirildi.NMR gözlegleri üçin, izotoplar bilen belok bellemek üçin 2 g D-glýukoza 13C (Aldrih) we 1 g ammiak hlorid 15N (Kembrij Isotope Laboratories, Inc.) bolan bakteriýalar M9 minimal gurşawda ösdürilip ýetişdirildi.Temperaturany 20 dereje peseldiň we 0,15 m izopropiltiogalaktopyranozid (soňky konsentrasiýa) bilen beloklaryň aňladylyşyna itergi beriň.Bir gijeki belokdan soň, öýjükler 7278 × g, 4 ° C 20 minutda ýygnaldy.Öýjük bölejikleri 20 mM Tris-HCl, pH 8-de üýtgedildi we mundan beýläk ulanylýança doňduryldy.Eredilen öýjükler 30 kPa-da öýjük bozujy (TS seriýaly maşynlar, Constant Systems Limited, Angliýa) ulanyp lizirlendi.Soňra lizatlar 25,000 g derejesinde 4 ° C-de 30 minutda merkezleşdirildi.NTMiSp üçin pellet soňra 2 M karbamid, 20 m Tris-HCl, pH 8 görnüşinde gaýtadan işledildi we 2 minut (2 s / off, 65%) sonikasiýa edildi, soň ýene 25,000 xg, 4 ° C derejesinde merkezleşdirildi. 30 min.Adatdan daşary tebigat Ni-NTA sütünine ýüklendi, 20 mM Tris-HCl, 2 m imidazol, pH 8 bilen ýuwuldy we ahyrynda belok 20 mM Tris-HCl, 200 m imidazol, pH 8. NT2RepCT döretmek we NTCT, trombin siňdiriş sahypasy (ThrCleav) bilen NT-iň arasynda tanyşdyrýar.Trombin ýarylýan ýerler His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep öndürýär), His-tioredoksin-ThrCleav-NT (NT öndürýär), His-tioredoksin-ThrCleav-CT (CT öndürýär), His-Tioredoksin-ThrCleav-NT-de bar. .*.Gurluşyklar trombin (1: 1000) bilen özleşdirildi we 6-8 kDa molekulýar agramy bolan Spektra / Por dializ membranasyny ulanyp, 20 mM Tris-HCl, pH 8 bilen 4 ° C-de bir gije dializ edildi.Dializden soň, ergin Ni-NTA sütünine ýüklenýär we gyzyklanma belogyny öz içine alýan akym ýygnalýar.Belok konsentrasiýalary, öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda Bradford barlagyny ulanan NTF1Sp-den başga her belogyň ýok bolmak koeffisiýentini ulanyp, UV siňdirişini 280 nm ölçemek arkaly kesgitlenildi.Arassalygy SDS poliakrilamid (4–20%) gel elektroforezi we Coomassie açyk gök reňk bilen kesgitlenildi.Beloklar sentrifuga süzgüçleri (VivaSpin 20, GE Healthcare) bilen 4000 xg-da 20 minutlyk aýlawda 10 kDa molekulýar agramy azaldyldy.
Belok erginini eritiň we 150 ml 1 ml arassa septum flakonyna (8 x 40 mm Termo Scientific) siňdiriň.Turbalar bugarmagyň öňüni almak üçin gaplandy we parafilm bilen möhürlendi.Nusgalar (n = 3) 37 ° C ýa-da 60 ° C inkubasiýa edildi we gelasiýany synlamak üçin wagtal-wagtal tersine.Gelmedik nusgalar azyndan bir hepde inkubasiýa edildi.NTMiSp disulfid baglanyşyklaryny 10 µM belok üçin 10 mM DTT azaltmak.Tebigy örümçek ýüpek örtükleriniň seljermesini seljermek üçin Şwesiýanyň köpri möýi kesildi, iki esasy ampulýasiýa bezegi 20 mM Tris-HCl bufer pH 8 200 μl ýerleşdirildi we örtügiň bezlerden aýrylmagy üçin kesildi..Bezleriň düzümi buferde, gury agramy kesgitlemek üçin 50 µl (açyk flakonlary hemişelik agramyna çenli inkubasiýa etmek arkaly) we 37 ° C-de jelasiýa üçin 150 µl erär.
Ölçeg geometri / gural, ýokarky diametri 20 mm we boşlugy 0,5 mm bolan parallel plastinkany ulanyp poslamaýan polatdan ýasalýar.Poslamaýan polatdan aşaky Peltier plastinkasyny ulanyp, nusgany 25 ° C-den 45 ° C-e we minutda 1 ° C derejesinde gyzdyryň.Wibrasiýa ölçegleri degişlilikde 100 mg / mL we 300–500 mg / mL nusgalary üçin 5% we 0,5% ştammda materialyň çyzykly viskoelastik sebitinde geçirildi.Buglanmagyň öňüni almak üçin adaty çyglylyk kamerasyny ulanyň.Prism 9 ulanyp, maglumatlar derňeldi.
Infragyzyl (IR) spektrleri otag temperaturasynda 800-den 3900 sm - 1 ýygnamak üçin.ATR enjamy, şeýle hem spektrometriň üsti bilen ýagtylyk ýoly, synagdan öň we wagtynda gury süzülen howa bilen arassalanýar.Eritmeler (spektrdäki suwuň siňdiriliş derejesini azaltmak üçin 500 mg / mL) kristallara çekildi we ölçemezden ozal jeller (500 mg / mL) emele geldi we soňra kristallara geçirildi (n = 3).1000 sm skaner 2 sm-1 durulykda we 2 nol nobat aýlawy bilen ýazga alyndy. Ikinji emele gelen dokuz nokadyň tekizleýiş diapazony bilen OPUS (Bruker) ulanylyp hasaplandy.Spektrler F. Mengesiň “Spektragrif - optiki spektroskopiýa programma üpjünçiligi” ulanyp, 1720-1580 sm-1 aralygynda şol bir integrasiýa sebitinde kadalaşdyryldy.ATR-IR spektroskopiýada, infragyzyl şöhläniň bir nusga aralaşmagy tolkun tolkunyna bagly bolup, aşaky tolkunlarda ýokary tolkunlara garanyňda has güýçli siňdirilýär.Bu täsirler, injirde görkezilen spektrler üçin düzedilmedi.3 gaty az bolany üçin (Goşmaça 4-nji surat).Bu şekil üçin düzedilen spektrler Bruker OPUS programma üpjünçiligi arkaly hasaplandy.
Aslynda, iň ýokary derejedäki bölekleriň ygtybarly dekonwolýusiýasyndan soň beloklaryň sazlaşykly mukdaryny kesgitlemek mümkindir.Şeýle-de bolsa, iş ýüzünde käbir päsgelçilikler ýüze çykýar.Spektrdäki sesler dekonwolýasiýa wagtynda (ýalan) pikler bolup biler.Mundan başga-da, suwuň egilmegi sebäpli iň ýokary derejedäki amidiň ýagdaýyna gabat gelýär we bu ýerde öwrenilen suw jeli ýaly köp mukdarda suwy öz içine alýan nusgalar üçin meňzeş ululyk bolup biler.Şol sebäpden, iň ýokary derejämiň arasyny doly dargatmaga synanyşmadyk we gözegçiliklerimiz diňe NMR spektroskopiýasy ýaly beýleki usullary goldamak üçin göz öňünde tutulmalydyr.
50 mg / ml NT we His-NT2RepCT erginleri bir gije 37 ° C-de garyndy.Soňra gidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) bilen 12,5 mg / ml konsentrasiýasyna suwuklandyryldy, gowy silkindi we jeli döwmek üçin turba çekildi.Ondan soň gidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) bilen 10 gezek garyndy, 5 μl nusga formwar bilen örtülen mis toruna ulanyldy we artykmaç nusga kagyz bilen aýryldy.Nusgalar 5 µl MilliQ suwy bilen iki gezek ýuwuldy we 5 minut üçin 1% uranil formaty bilen boýaldy.Siňdiriji kagyz bilen artykmaç tegmilleri aýyryň, soňra howany guradyň.Suratlar 100 kW-da işleýän FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ulanyp, bu gözeneklerde geçirildi.Suratlar Veleta 2k × 2k CCD kamerasy (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germaniýa) arkaly x 26,500 we x 43,000 ulaldyldy.Her nusga üçin (n = 1) 10-15 sany surat ýazga alyndy.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) şekil derňewi we süýümiň diametrlerini ölçemek üçin ulanyldy (n = 100, dürli süýümler).“Prism 9” jübütlenmedik t-synaglary (iki guýrukly) ýerine ýetirmek üçin ulanyldy.Ortaça His-NT2RepCT we NT fibrilleri degişlilikde 11.43 (SD 2.035) we 7.67 (SD 1.389) nm boldy.Ynam aralygy (95%) -4.246 -3.275 aralygy.azatlyk derejeleri = 198, p <0.0001.
10 µM tioflawin T (ThT) öz içine alýan 80 µl suwuk nusgalar üçburçlukda (n = 3) statiki şertlerde Corning 96 guýy gara aşaky aşaky aşaky plitalary (Corning Glass 3881, ABŞ) ulanyp ölçenildi.Floresan tapawudy 440 nm tolgundyryjy süzgüç we 480 nm zyňyndy süzgüji (BMG Labtech-den FLUOStar Galaxy, Offenburg, Germaniýa) arkaly hasaba alyndy.ThT signaly ne doýdy, ne-de söndürildi, sebäbi signalyň intensiwligini üýtgetmän ThT dürli konsentrasiýalary bilen synaglar geçirildi.Duman ölçemek üçin 360 nm-de siňdirişi ýazga alyň.Ekiş synaglary üçin 37 ° C-de 100 mg / mL jel emele geldi, gaýtadan işledildi we 5%, 10% we 20% nisbatlarynda ekiş üçin ulanyldy.Prism 9 ulanyp, maglumatlar derňeldi.
His-NT2RepCT we NT> 100 mg / ml buzda eremeli we 0,22 mkm süzgüç arkaly süzüň.Konsentrasiýalar, Nanodrop ulanyp, 280 nm sorulmagy ölçemek bilen hasaplandy.Açyk düýbi bolan 96 guýy gara baglaýjy plastinkanyň (Corning) guýularynda 20 mM Tris-HCl pH 8-de 20 mg / ml çenli suwuklandyryldy we 5 μM ThT (jemleýji konsentrasiýa) bilen garyndy, umumy nusga konsentrasiýasy 50 volumel göwrüm.Nusgalar her 10 minutdan 37 ° C-de CellObserver (Zeiss) mikroskopynda geçirilýän ýagtylyk kanaly we ThT surata düşürmek üçin FITC tolgundyryş we zyňyndy süzgüç toplumlary bilen şekillendirilýärdi.Surata almak üçin 20x / 0.4 linza ulanylýar.Surat derňewi üçin Zen Mawy (Zeiss) we ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ulanyldy.Geller, şeýle hem, 20 mM Tris pH 8 we 5 µM ThT bolan 50 mg / mL konsentrasiýasynda NT we His-NT2RepCT erginlerinden taýýarlandy we 90 minut üçin 37 ° C inkubasiýa edildi.Jel bölekleri, 20 mM Tris, pH 8 we 5 μM ThT bolan täze guýa, hökmany däl gara 96 ​​guýynyň aşaky plastinkasyna geçirildi.20x / 0.4 ulalanda ýaşyl floresan we açyk meýdan şekillerini alyň.ImageJ şekil derňewi üçin ulanyldy.
“NMR” çözgüdi, QCI dörtburç rezonans Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) bilen enjamlaşdyrylan 600 MGts Bruker Avance Neo spektrometrinde 310 K tizlikde alyndy.13C, 15N belgili 10 mg / mL birmeňzeş belogy öz içine alýan NMR nusgalary, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w / v) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) .15N-HSQC 2D spektrinde iň ýokary 23 bellemek üçin NT 6.RepCT-iň pH 6.7-de himiki çalşyklary ulanyldy.
Jadyly burç aýlanýan gaty NMR (MAS) spektri 13C, 15N belgili gidrogeller, Bruker Avance III HD spektrometrinde 3,2 mm 13C / 15N {1H} elektronsyz zond bilen enjamlaşdyrylan 800 MGs-da ýazga alyndy.Mysal temperaturasy 277 K.-da üýtgeýän temperatura gaz akymynyň kömegi bilen gözegçilik edildi, iki ölçegli dipol aýlanma rezonansy (DARR) 76 we radio ýygylygy täzeden birikdirmek (RFDR) 77 spektr degişlilikde MAS ýygylyklarynda 12.5 kHz we 20 kHz.Kesgitli polýarizasiýa (CP) 1H-den 13C-e çenli 1H-de 60.0-dan 48.0 kHz çyzykly rampa, 13C-de 61,3 / 71,6 kHz (12.5 / 20 kHz MAS) we aragatnaşyk wagty 0,5-1 ms.Maglumat ýygnamak wagtynda 73.5 kHz tizlikde oňurga 6478 bölmek ulanyldy.Satyn almagyň wagty 10 millisekunt, aýlawyň gijä galmagy 2,5 sekunt boldy.RFDR spektrinde syn edilen ýeke-täk Cα / Cβ korrelýasiýalary galyndy görnüşli himiki üýtgemelere we DARR spektrinde köp baglanyşykly korrelýasiýalara esaslandy.
Zipper79 maglumat bazasy (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp we NTMiSp üçin çişme meýillerine we Rosetta energiýasyna baha bermek üçin ulanyldy.Zipper maglumatlar bazasy, belok gurluşyny modellemek we seljermek üçin birnäçe erkin energiýa funksiýalaryny birleşdirýän Rosetta Energy80-ni hasaplaýar.-23 kkal / mol ýa-da ondan pes energiýa derejesi fibrillatyň ýokary tendensiýasyny görkezýär.Aşaky energiýa, fermuar görnüşinde iki β setiriň has durnuklylygyny aňladýar.Mundan başga-da, NT, NTFlSp we NTMiSp Ref-de amiloidogen sebitleri çaklamak üçin Wals algoritmi ulanyldy.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT belok ergini pH-ni pH 6 we 7-e çenli peseltmek üçin pH 5.5 we 6.0 derejesinde 2- (N-morfolino) etanesulfon kislotasy (MES) buferi bilen garyndy.Belokyň soňky konsentrasiýasy 100 mg / ml boldy.
Ölçegler J-1500 CD spektrometrinde (JASCO, ABŞ) optiki ýoly 0,1 sm bolan 300 μL kwetta ulanylyp geçirildi.Beloklar 20 mM fosfat buferinde (pH 8) 10 μM (n = 1) suwuklandyryldy.Duzyň barlygynda beloklaryň durnuklylygyny seljermek üçin, beloklar degişlilikde 154 mM NaF ýa-da NaCl bolan 20 m fosfat buferinde (pH 8) şol bir konsentrasiýada (n = 1) analiz edildi.Temperaturany barlamak 222 nm-den 25 ° C-den 95 ° C-e çenli gyzdyryş tizligi 1 ° C / min.Eplenen bukulan beloklaryň paýy (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal) formulasy bilen hasaplandy.Mundan başga-da, her nusga üçin 260 nm-den 190 nm-e 25 ° C-de we 95 ° C-e çenli gyzdyrylandan soň bäş spektr ýazga alyndy.Bäş spektr ortaça, tekizlenip, molar elliptiklige öwrüldi.Prism 9 ulanyp, maglumatlar derňeldi.
His-NT-GFP (300 mg / mL, 80 µL) floresan intensiwligi statiki şertlerde gara reňkli aşagy (Corning Glass 3881, ABŞ) 96 guýy Corning plitalarynda üçlükde (n = 3) ölçenildi.395 nm tolgundyryjy tolkun uzynlygy bilen floresan esasly plastinka okaýjy bilen nusgalary ölçäň we zyňyndy jelleşmezden 509 nm, 2 sagatdan bolsa 37 ° C-de ýazyň.Prism 9 bilen maglumatlar derňeldi.
Öndürijiniň görkezmesine laýyklykda purin nukleozid fosforilaz işjeňlik barlag toplumy (florometrik usul, Sigma Aldrih) ulanyldy.Gellerde we His-NT-PNP bolan erginlerde işjeňligi ölçemek üçin, 10-ng His-NT-PNP-ni 100 mg / mL NT bilen umumy göwrümine 2 µL garyşdyryň, sebäbi jel toplumyň kesgitleme aralygyndan ýokary signal berdi.Gel-ler we His-NT-PNP bolmazdan çözgütler girizildi.Ölçegler iki gezek geçirildi (n = 2).Hereket ölçelenden soň, reaksiýa garyndysy aýryldy we ölçeg wagtynda jeliň üýtgemezligini üpjün etmek üçin jel surata düşdi.Prism 9 ulanyp, maglumatlar derňeldi.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin bu makala bilen baglanyşykly Tebigaty öwreniş abstraktyna serediň.
1-nji we 2-nji suratlar başlangyç maglumatlary görkezýär.1c, 2a - c, 3a, b, e - g, 4, 5b, d, f we 6, Goşmaça injir.3, goşmaça injir.5a, d, goşmaça injir.6 we goşmaça injir.8. Bu gözlegiň maglumatlary Zenodo maglumatlar bazasynda ýerleşýär https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Bu gözlegde alnan NMR maglumatlary BMRBig ammaryna giriş belgisi bmrbig36 astynda ýerleşdirildi.GFP we PNP gurluşlary PDB-den (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) alyndy.
Rising, A. we ansohansson, J. Emeli egriji ýüpek.Milli himiýa.biologiýa.11, 309–315 (2015).
Babb, PL we ş.m.“Nephila clavipes” genomy, möý ýüpek genleriniň dürlüligini we çylşyrymly görnüşini görkezýär.Milli genetika.49, 895–903 (2017).