Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.

317 Poslamaýan polatdan ýasalan turbalar bilen üpjün edijiler

Poslamaýan polatdan ýasalan materiallaryň himiki düzümi

SPACA6 süýdemdirijileriň jyns taýdan köpelmegi wagtynda gamete birleşmegi üçin möhüm bolan sperma bilen aňladylýan ýerüsti belokdyr.Bu esasy rola garamazdan, SPACA6-yň aýratyn funksiýasyna gowy düşünilmeýär.SPACA6-dan daşary öýjügiň domeniniň kristal gurluşyny 2,2 Å durulykda düşündirýäris, dört hatar bukjadan we kwaz-çeýe baglaýjylar bilen birleşdirilen Ig ýaly sand-sandwiçlerden ybarat iki domen belogyny açýarys.Bu gurluş, gamete birleşmek bilen baglanyşykly başga bir belok IZUMO1-e meňzeýär, SPACA6 we IZUMO1 tohumlandyrma bilen baglanyşykly beloklaryň superfamilyasynyň esaslandyryjy agzalaryny döredýär, bu ýerde IST superfamily diýilýär.IST super maşgalasy, dört sany gelix bukjasy we disulfid bilen baglanyşykly CXXC jübütleri bilen gurluş taýdan kesgitlenýär.Adam proteomynyň gurluşyna esaslanýan “AlphaFold” gözlegi bu super maşgalanyň goşmaça belok agzalaryny kesgitledi;bellemeli zat, bu beloklaryň köpüsi gamete birleşmegine gatnaşýar.SPACA6 gurluşy we IST maşgalasynyň beýleki agzalary bilen gatnaşygy, süýdemdirijileriň gamete birleşmegi baradaky bilimimizde ýiten baglanyşygy üpjün edýär.
Adamyň her bir durmuşy iki aýry gaploid gametden başlaýar: kakanyň spermasy we enäniň ýumurtgasy.Bu sperma, millionlarça sperma öýjükleriniň aýal jyns ýollaryndan geçip, dürli päsgelçilikleri ýeňip geçip, hereketini we ýerüsti komponentleriň işini güýçlendirýän güýçli saýlama prosesiniň ýeňijisidir.Sperma bilen oosit biri-birini tapsa-da, proses entek gutarmaýar.Oosit jemulus öýjükleriniň gatlagy we zona pellucida atly glikoprotein barýer bilen gurşalandyr, oositiň içine sperma geçmeli.Spermatozoa bu soňky päsgelçilikleri ýeňip geçmek üçin ýerüsti ýelmeýän molekulalaryň we membrana bilen baglanyşykly we gizlin fermentleriň birleşmesini ulanýar5.Bu molekulalar we fermentler esasan içki membranada we akrosomal matrisada saklanýar we akrosomal reaksiýa wagtynda spermyň daşky membranasy lizlenende ýüze çykarylýar6.Bu güýçli syýahatyň soňky ädimi, iki öýjük membranalaryny birleşdirip, bir diploid organizm bolmak üçin sperma-ýumurtga birleşmek hadysasydyr7.Bu proses adamyň köpelmeginde düýbüni tutýan hem bolsa, zerur molekulýar täsirlere gowy düşünilmeýär.
Gametalaryň tohumlandyrylmagyna goşmaça, iki lipid bilýeriň birleşmeginiň himiýasy giňden öwrenildi.Umuman alanyňda, membrananyň birleşmegi, iki membranany has ýakynlaşdyrýan, dowamlylygyny bozup, birleşmegine sebäp bolýan gurluş katalizatorynyň gurluş üýtgemelerini talap edýän energiýa taýdan amatsyz prosesdir.Bu belok katalizatorlary fusogenler diýlip atlandyrylýar we sansyz birleşme ulgamlarynda tapyldy.Öýjükli öýjüklere wirusly girmek üçin (mysal üçin, AIW-1-de gp160, koronawiruslarda köpelmek, grip wiruslarynda gemagglutinin) 10,11,12 plasental (sinkintin) 13,14,15 we aşaky eukariotlarda gamete emele getirýän birleşmeler talap edilýär. Ösümliklerde, protistlerde we artropodlarda HAP2 / GCS1) 16,17,18,19.Adamyň gametleri üçin fusogenler entek tapylmady, ýöne birnäçe beloklaryň gamete birikdirilmegi we birleşmegi üçin möhüm ähmiýete eýe.Syçan bilen adam gametleriniň birleşmegi üçin zerur bolan transmembran belogy bolan oosit bilen aňladylan CD9 ilkinji bolup 21,22,23 tapyldy.Takyk funksiýasy näbelliligine galsa-da, ýelmeşmekde rol, ýumurtga mikrowilindäki ýelim fokuslarynyň gurluşy we / ýa-da oosit ýerüsti beloklaryň dogry lokalizasiýasy 24,25,26 bolup görünýär.Gametiň birleşmegi üçin iň möhüm iki belok, sperm belogy IZUMO127 we oosit belogy JUNO28 bolup, olaryň birleşmegi gamete tanamakda we birleşmezden ozal ýelmeşmekde möhüm ädimdir.Erkek Izumo1 nokaut syçanlary we Juno aýal nokaut syçanlary düýbünden önelgesizdir, bu modellerde sperma perivitellin giňişligine girýär, ýöne gametler birleşmeýär.Edil şonuň ýaly-da, in vitro tohumlandyryş synaglarynda gametlere anti-IZUMO1 ýa-da JUNO27,29 antikorlary bilen bejerilende birleşmek azaldy.
Recentlyakynda, IZUMO1 we JUNO20,30,31,32,33,34,35 meňzeş fenotipiki taýdan sperm bilen aňladylan beloklaryň topary tapyldy.Sperm akrosomal membrana bilen baglanyşykly belok 6 (SPACA6), uly göwrümli murin mutagenez gözleginde tohumlandyrmak üçin zerur diýlip kesgitlenildi.Transgeni Spaca6 genine salmak, ýakymsyz spermatozoa öndürýär, ýöne bu spermatozoidler perivitellin giňişligine 36 girýär.Syçanlarda geçirilen soňky nokaut gözlegleri, Spaca6-nyň gamete birleşmegi üçin 30,32 gerekdigini tassyklady.SPACA6 diňe synaglarda diýen ýaly aňladylýar we IZUMO1 bilen meňzeş lokalizasiýa nagşy bar, ýagny akrosomal reaksiýadan öň spermatozoidiň içinden, 30,32 akrosomal reaksiýadan soň ekwatorial sebite göçýär.“Spaca6” gomologlary dürli süýdemdirijilerde we beýleki eukariotlarda bar we adam gametiniň birleşmegi üçin ähmiýeti, SPACA6 30 garşylygy bilen vitroda adam tohumlandyrylmagynyň gadagan edilmegi bilen görkezildi.IZUMO1 we JUNO-dan tapawutlylykda, SPACA6-nyň gurluşy, özara täsiri we işleýşiniň jikme-jiklikleri näbelliligine galýar.
Maşgalany meýilleşdirmekde we önelgelilik bejergisinde geljekdäki wakalary habar bermäge mümkinçilik berýän adam spermalarynyň we ýumurtgalarynyň birleşmeginiň esasy prosesine has gowy düşünmek üçin SPACA6 gurluş we biohimiýa gözleglerini geçirdik.SPACA6-dan daşary öýjükli domeniň kristal gurluşy dört sany dik bukjany (4HB) we kwaz-çeýe sebitler bilen birleşdirilen immunoglobuline meňzeş (Ig ýaly) domeni görkezýär.Öňki gözleglerde çak edilişi ýaly, SPACA6-nyň domen gurluşy adam IZUMO1-e meňzeýär we iki belok adaty bolmadyk bir sebäbini paýlaşýar: üçburçluk dikligine 4HB we disulfid bilen baglanyşykly CXXC jübütleri.IZUMO1 we SPACA6-nyň indi gamete birleşmegi bilen baglanyşykly beloklaryň has uly, gurluş taýdan baglanyşykly super maşgalasyny kesgitlemegini teklip edýäris.Öý maşgalasyna mahsus aýratynlyklary ulanyp, “AlphaFold” gurluş adam proteomyny doly gözledik, bu super maşgalanyň goşmaça agzalaryny, şol sanda gamete birleşmegine we / ýa-da tohumlandyrmaga gatnaşýan birnäçe agzany kesgitledik.Indi gamete birleşmegi bilen baglanyşykly umumy gurluş gatlagy we beloklaryň köp maşgalasy bar ýaly görünýär we biziň gurluşymyz adam gamete birleşmek mehanizminiň bu möhüm tarapynyň molekulýar kartasyny üpjün edýär.
SPACA6, bir N bilen baglanyşykly glikan we alty sany disulfid baglanyşygy bolan bir gezeklik transmembranly belokdyr (S1a we S2 suratlar).Drosophila S2 öýjüklerinde adam SPACA6 (galyndylary 27–246) öýjükden daşary domenini mälim etdik we nikeli ýakynlygy, kation alyş-çalşygy we ululygy aýyrmak hromatografiýasy arkaly belogy arassaladyk (S1b surat).Arassalanan SPACA6 ektodomain gaty durnukly we birmeňzeşdir.Ululygy aýyrmak hromatografiýasyny ulanmak arkaly geçirilen derňew, köpburçly ýagtylygyň ýaýramagy (SEC-MALS) bilen hasaplanan molekulýar agramy 26.2 ± 0,5 kDa (S1c surat) bilen iň ýokary derejäni ýüze çykardy.Bu, SPACA6 monomeriki ektodomainiň ululygyna laýyk gelýär, arassalamak wagtynda oligomerizasiýanyň ýüze çykmandygyny görkezýär.Mundan başga-da, tegelek diokroizm (CD) spektroskopiýa 51,3 ° C ereýän nokady bolan garyşyk α / β gurluşy ýüze çykardy (S1d, e).CD spektriniň dekonwolýusiýasy 38,6% hel dik we 15,8% β zolakly elementleri ýüze çykardy (S1d surat).
SPACA6 ektodomain, tötänleýin matrisa ekişi 38 arkaly kristallaşdyryldy, netijede 2,2 Å durulykda maglumatlar toplumy (1-nji tablisa we S3 surat).Böleklere esaslanýan molekulýar çalyşma we SAD tapgyrlaýyn maglumatlary gurluşy kesgitlemek üçin bromid täsiri bilen birleşdirmek (1-nji tablisa we S4-nji surat), iň soňky arassalanan model 27–246 galyndylardan ybarat.Gurluşy kesgitlenende hiç hili eksperimental ýa-da AlphaFold gurluşy ýokdy.SPACA6 ektodomainiň ölçegi 20 Å × 20 Å × 85 Å, ýedi gabykdan we dokuz sany setirden ybarat we alty sany disulfid baglanyşygy bilen durnuklaşdyrylan uzyn üçünji gatlagy bar (1a surat, b).Asn243 gapdal zynjyrynyň ujundaky gowşak elektron dykyzlygy, bu galyndynyň N bilen baglanyşykly glikozilasiýa bolandygyny görkezýär.Gurluşy iki domenden ybarat: N terminaly dört gelix bukjasy (4HB) we olaryň arasynda aralyk halka sebiti bolan C terminaly Ig ýaly domen (1-nji surat).
SPACA6-dan daşary domeniň gurluşy.SPACA6-dan daşary öýjükli domeniň zolak diagrammasy, zynjyryň reňki N-den C terminine çenli goýy gökden goýy gyzyl reňkde.Disulfid baglanyşyklaryna gatnaşýan sisteinler magentada görkezilýär.b SPACA6 öýjükden daşary domeniň topologiýasy.1a suratdaky ýaly reňk shemasyny ulanyň.c SPACA6 öýjükden daşary domen.4HB, ilik we Ig ýaly domen zolak çyzgylary degişlilikde mämişi, ýaşyl we gök reňkli.Gatlaklar masştab üçin çekilmeýär.
SPACA6-nyň 4HB domeni, antiparallel we paralel täsirleriň arasynda üýtgäp duran geliç (2a surat) görnüşinde ýerleşdirilen dört sany esasy gabygy (1–4 helel) öz içine alýar (2-nji surat).Bukja perpendikulýar bolup, 1 we 2 kysymly üçburçluk emele getirýän kiçijik goşmaça bir gezeklik gelix (gelix 1 ′) goýulýar we bu üçburçluk 3 we 4-nji gabyklaryň has dykyz gaplanyşynyň dikligine bükülen gaplamasynda birneme deformasiýa edilýär ( 2a surat).
4HB N terminaly zolak diagrammasy.b Dört sany gabykdan ybarat ýokarky görnüş, her gelix N-terminusda goýy gök reňkde we C terminalynda goýy gyzyl reňkde görkezilýär.c 4HB üçin ýokarky spiral tigir diagrammasy, her galyndy bir harply aminokislota kody bilen tegelek görnüşde görkezilýär;tigiriň ýokarsyndaky diňe dört aminokislotalar sanlanýar.Polýar däl galyndylar sary, polýar zarýad berilmedik galyndylar ýaşyl reňkde, pololyitel zarýadlanan galyndylar gök reňkde, negatiw zarýadly galyndylar gyzyl reňkde bolýar.d 4HB domeniniň üçburçluk ýüzleri, 4HB mämişi reňkde we ýaşyl reňkde.Iki goşmaçada hasa görnüşli disulfid baglanyşyklary görkezilýär.
4HB esasan alifatiki we ysly galyndylardan ybarat içki gidrofob ýadrosynda jemlenendir (2-nji surat).Coreadro, Cys41 bilen Cys55 arasynda disulfid baglanyşygyny öz içine alýar, 1 we 2-nji gabyklary ýokarky beýik üçburçlukda birleşdirýär (2-nji surat).Helix 1 in-de CXXC motif bilen çeňňek sebitindäki hair saçyň ujundan tapylan başga bir CXXC motifiniň arasynda iki sany goşmaça disulfid baglanyşygy emele geldi (2-nji surat).Näbelli funksiýa (Arg37) bilen konserwatiw argin galyndysy 1 ′, 1 we 2 kelleleri bilen emele gelen çukur üçburçlugyň içinde ýerleşýär, Cβ, Cγ we Cδ Arg37 alifatiki uglerod atomlary gidrofob ýadrosy bilen täsirleşýär we guanidin toparlary aýlawly hereket edýärler Thr32 oňurga we gapdal zynjyryň özara täsirleri arkaly 1 ′ we 1 helelleriň arasynda (S5a, b).Tyr34, Arg37 çözüji bilen täsirleşip bilýän iki sany kiçijik boşluk goýup, boşluga ýaýraýar.
Ig ýaly sand-sendwiç domenleri, gidrofobiki ýadro arkaly täsirleşýän iki ýa-da has köp zolakly amfipatiki listleriň umumy aýratynlygyny paýlaşýan beloklaryň köp maşgalasydyr. SPACA6-nyň C terminaly Ig ýaly domeniniň birmeňzeş görnüşi bar we iki gatlakdan durýar (S6a surat).1-nji sahypa dört setirden ybarat (D, F, H we I setirler), bu ýerde F, H setirleri bar, men bolsa paralele garşy tertip döredýärin we I we D setirler parallel täsir edýär.2-nji tablisa paralele garşy iki hatar beta sahypasy (E we G setirleri).E zynjyryň C terminaly bilen H zynjyrynyň merkezi (Cys170-Cys226) arasynda içerki disulfid baglanyşygy synlandy (S6b surat).Bu disulfid baglanyşygy immunoglobuliniň 40,41 dom sandwiç domenindäki disulfid baglanyşygyna meňzeýär.
Dört setirli list, tutuş uzynlygy boýunça öwrüm edip, görnüşi we elektrostatikasy bilen tapawutlanýan asimmetrik gyralary emele getirýär.Has inçe gyrasy, SPACA6-da galan deň däl we elektrostatiki dürli ýüzler bilen deňeşdirilende tekiz gidrofobiki daşky gurşawdyr (S6b surat, c).Açylan oňurgaly karbonil / amin toparlary we polýar gapdal zynjyrlar gidrofobiki ýüzüni gurşap alýar (S6c surat).Has giň margin, gidrofob ýadrosynyň N terminaly bölegini bloklaýan we F zynjyr oňurgasynyň açyk polýar topary bilen üç sany wodorod baglanyşygyny emele getirýän ýapyk görnüşli segment bilen örtülendir (S6d surat).Bu gyranyň C terminaly bölegi, bölekleýin açyk gidrofob ýadrosy bolan uly jübini emele getirýär.Jübüt goşa argin galyndylarynyň üç toplumy (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 we Arg212-Arg214) we merkezi histidin (His220) sebäpli polo positiveitel zarýadlar bilen gurşalan.
Çeňňek sebiti, dik domen bilen Ig ýaly domeniň arasynda gysga segment bolup, bir antiparallel üç hatar gatlakdan (A, B we C setirler), kiçi 310 gelixden we birnäçe uzyn tötänleýin dik böleklerden ybarat.(S7-nji surat).Çeňňek sebitindäki kowalent we elektrostatik aragatnaşyklar ulgamy 4HB bilen Ig ýaly domeniň arasyndaky ugry durnuklaşdyrýan ýaly.Tor üç bölege bölünip bilner.Birinji bölümde iki sany CXXC motif (27CXXC30 we 139CXXC142) bar, olar gysgyçdaky β saçly saç bilen 4HB-de 1 ′ gelix arasynda jübüt disulfid baglanyşygyny emele getirýär.Ikinji bölüm, Ig ýaly domen bilen iligiň arasyndaky elektrostatik täsirleri öz içine alýar.Çukurdaky Glu132, Ig ​​ýaly domende Arg233 we çeňňekde Arg135 bilen duz köprüsini emele getirýär.Üçünji bölüm, Ig ýaly domen bilen ilik sebitiniň arasynda kovalent baglanyşygy öz içine alýar.Iki sany disulfid baglanyşygy (Cys124-Cys147 we Cys128-Cys153), halka aýlawyny Gln131 bilen oňurgaly funksional toparyň arasynda elektrostatik täsirleşmeler arkaly durnuklaşdyrylan baglanyşdyryjy bilen baglanyşdyrýar, bu ilkinji Ig ýaly domene girmäge mümkinçilik berýär.zynjyr.
SPACA6 ektodomainiň gurluşy we 4HB we Ig ýaly domenleriň aýratyn gurluşlary 42 belok bazalarynda gurluş taýdan meňzeş ýazgylary gözlemek üçin ulanyldy.Highokary Dali Z ballary, kiçi standart gyşarmalar we uly LALI ballary bilen gabat gelýänleri kesgitledik (ikinjisi gurluş taýdan ekwiwalent galyndylaryň sany).Doly ektodomain gözleginden (S1 Tablisa) kabul ederlikli Z-bal> 842 bar bolsa, diňe 4HB ýa-da Ig ýaly domen gözlemek bu hitleriň köpüsiniň diňe sandwiçlere laýyk gelýändigini görkezdi.köp belokda tapylan hemme ýerde.Dalidäki üç gözlegiň hemmesi diňe bir netijäni berdi: IZUMO1.
SPACA6 we IZUMO1-iň gurluş meňzeşlikleri7,32,37 paýlaşýandygy öňden bäri teklip edilýär.Bu iki gamete birleşmek bilen baglanyşykly beloklaryň ektodomainleriniň diňe 21% yzygiderliligi bar bolsa-da (S8a surat), konserwirlenen disulfid baglanyşyk nagşy we SPACA6-da çaklanylýan C terminaly Ig ýaly domen ýaly çylşyrymly subutnamalar, irki synanyşyklara mümkinçilik berdi. Şablon hökmünde IZUMO1 ulanyp, A SPACA6 syçanjygynyň gomologiýa modeli37.Gurluşymyz bu çaklamalary tassyklaýar we meňzeşligiň hakyky derejesini görkezýär.Aslynda, SPACA6 we IZUMO137,43,44 gurluşlar birmeňzeş 4HB we çeňňek sebiti bilen birleşdirilen Ig-sandwiç domenleri bilen birmeňzeş iki domen arhitekturasyny paýlaşýarlar (S8c surat).
IZUMO1 we SPACA6 4HB adaty spiral paketlerinden umumy tapawutlary bar.Adaty 4HB-ler, 45,46 endosomal birleşmä gatnaşýan SNARE belok toplumlarynda bolşy ýaly, merkezi okuň töwereginde hemişelik egriligi saklaýan dwigateller bilen deň aralykda ýerleşýär. Munuň tersine, IZUMO1 we SPACA6-daky dik domenler üýtgeýän egrilik we deň däl gaplamak (S8d surat).1 ′, 1 we 2 helellerden emele gelen üçburçluk sebäpli dörän öwrüm, IZUMO1 we SPACA6-da saklanýar we gelix 1 on şol bir CXXC hereketi bilen durnuklaşdyrylýar.Şeýle-de bolsa, SPACA6-dan tapylan goşmaça disulfid baglanyşygy (ýokardaky 1 we 2 gabyklary birleşdirýän Cys41 we Cys55) üçburçluk depesinde has ýiti depäni döredýär we SPACA6-ny IZUMO1-den has öwrümli we has açyk boşluk üçburçluklary bilen döredýär.Mundan başga-da, IZUMO1-de SPACA6-da bu boşlugyň merkezinde syn edilýän Arg37 ýok.Munuň tersine, IZUMO1 alifatiki we ysly galyndylaryň has adaty gidrofob ýadrosyna eýe.
IZUMO1, iki hatar we bäş hatar she sahypadan ybarat Ig görnüşli domen bar.IZUMO1-de goşmaça setir, F strand bilen özara täsirleşýän SPACA6-da rulonyň ornuny tutýar, bu sütündäki oňurga wodorod baglanyşyklaryny çäklendirýär.Deňeşdirmegiň gyzykly nokady, iki belokyň Ig ýaly domenleriniň çak edilýän ýerüsti zarýady.IZUMO1 üstü, SPACA6 ýüzüne garanyňda has negatiw zarýadlanýar.Goşmaça zarýad, sperma membranasyna seredýän C termininiň golaýynda ýerleşýär.SPACA6-da şol sebitler has bitarap ýa-da pololyitel zarýad alýardy (S8e surat).Mysal üçin, SPACA6-daky gidrofobiki ýer (inçe gyralar) we pololyitel zarýadly çukurlar (has giň gyralar) IZUMO1-de negatiw zarýadlanýar.
IZUMO1 bilen SPACA6 arasyndaky gatnaşyklar we ikinji derejeli gurluş elementleri gowy saklanandygyna garamazdan, Ig ýaly domenleriň gurluş taýdan deňleşdirilmegi bu iki domeniň umumy ugry boýunça biri-birine görä tapawutlanýandygyny görkezdi (S9-njy surat).IZUMO1-iň spiral bukjasy β-sendwiç hakda egrelip, merkezi okdan takmynan 50 ° töweregi öň beýan edilen "bumerang" görnüşini döredýär.Munuň tersine, SPACA6-daky dik şöhle tersine 10 ° töweregi egildi.Bu ugurlardaky tapawutlar, ähtimal, sebitdäki tapawutlar bilen baglanyşyklydyr.Esasy yzygiderlilik derejesinde, IZUMO1 we SPACA6, sistein, glisin we aspartik kislotanyň galyndylaryndan başga, çeňňekde yzygiderliligiň az meňzeşligi bar.Netijede, wodorod baglanyşyklary we elektrostatik torlar düýbünden başga.β sahypaly ikinji derejeli gurluş elementleri IZUMO1 we SPACA6 bilen paýlaşylýar, IZUMO1-de zynjyrlar has uzyn we 310 gelix (gelix 5) SPACA6-a mahsus.Bu tapawutlar, başgaça meňzeş iki belok üçin dürli domen ugurlaryny döredýär.
Dali serwer gözlegimiz, SPACA6 we IZUMO1, beloklar bazasynda bu aýratyn 4HB eplenýän (S1 Tablisa) saklanýan ýeke-täk synag taýdan kesgitlenen gurluşdygyny ýüze çykardy.Golaýda, DeepMind (Alphabet / Google), beloklaryň 3D gurluşlaryny başlangyç yzygiderlilikden takyk çaklap bilýän nerw ulgamyna esaslanýan ulgam AlphaFold-ny döretdi48.SPACA6 gurluşyny çözenimizden gysga wagt soň, adam proteomundaky ähli beloklaryň 98,5% -ini öz içine alýan çaklaýyş gurluş modellerini hödürleýän AlphaFold maglumatlar bazasy çykdy.Gözleg modeli hökmünde çözülen SPACA6 gurluşymyzy ulanyp, “AlphaFold” adam proteomynda model üçin gurluş gomologiýa gözlegi, SPACA6 we IZUMO1 bilen gurluş taýdan meňzeşligi bolan dalaşgärleri kesgitledi.“AlphaFold” -yň SPACA6 (S10a surat) çaklamakda ajaýyp takyklygyny göz öňünde tutup, esasanam çözülen gurluşymyz bilen deňeşdirilende 1,1 m r ektodomain - kesgitlenen SPACA6 oýunlarynyň takyk boljakdygyna ynam edip bileris.
Ondan öň PSI-BLAST sperma bilen baglanyşykly beýleki üç belok bilen IZUMO1 toparyny gözledi: IZUMO2, IZUMO3 we IZUMO450.“AlphaFold” bu IZUMO maşgala beloklarynyň 4HB domenine, IZUMO1 (3a we S11 suratlar) ýaly disulfid baglanyşyk nagşy bilen bukulýandygyny çaklady, emma Ig ýaly domen ýok.IZUMO2 we IZUMO3, IZUMO1 meňzeş bir taraply membranaly beloklar, IZUMO4 bolsa gizlin ýaly görünýär.IZUMO 2, 3 we 4 belokyň gamete birleşmegindäki funksiýalary kesgitlenmedi.IZUMO3 spermatozoidiň ösüş döwründe akrosoma biogenezinde rol oýnaýandygy mälimdir we IZUMO belogy çylşyrymly50 emele getirýär.Süýdemdirijilerde, süýrenijilerde we ýerde-suwda ýaşaýanlarda IZUMO beloklarynyň goralyp saklanmagy, olaryň potensial işiniň DCST1 / 2, SOF1 we ​​FIMP ýaly belli gamete-birleşmek bilen baglanyşykly beloklara laýyk gelýändigini görkezýär.
4HB, çeňňek we Ig ýaly domenler degişlilikde apelsin, ýaşyl we gök reňklerde görkezilen IST superfamilyanyň domen arhitekturasynyň diagrammasy.IZUMO4-de gara görünýän özboluşly C terminaly sebiti bar.Tassyklanan we goýlan disulfid baglanyşyklary degişlilikde gaty we punktir çyzyklar bilen görkezilýär.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) A. paneli bilen birmeňzeş reňkde görkezilýär. Disulfid baglanyşyklary magentada görkezilýär.TMEM95, IZUMO2 we IZUMO3 transmembran helelleri görkezilmeýär.
IZUMO belogyndan tapawutlylykda beýleki SPACA beloklary (ýagny, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 we SPACA9) gurluş taýdan SPACA6-dan tapawutly hasaplanýar (S12-nji surat).Diňe SPACA9-da 4HB bar, ýöne paralel-paralel ugra ýa-da SPACA6 bilen birmeňzeş disulfid baglanyşygyna garaşylmaýar.Diňe SPACA1-de şuňa meňzeş Ig ýaly domen bar.“AlphaFold”, SPACA3, SPACA4 we SPACA5-iň SPACA6-dan düýpgöter tapawutlydygyny çaklaýar.Gyzykly tarapy, SPACA4 tohumlandyrylmada hem rol oýnaýar, ýöne SPACA6-dan has köp, sperma we oosit zona pellucida52 arasynda özara täsirleşmegi ýeňilleşdirýär.
“AlphaFold” gözlegimiz IZUMO1 we SPACA6 4HB, TMEM95 üçin başga bir gabat geldi.Sperm-spesifik transmembran belogy bolan TMEM95, 32,33 ablasiýa edilende erkek syçanlary önelgesiz edýär.TMEM95 ýetmezçiligi bolan spermatozoidleriň adaty morfologiýasy, hereketi we zona pellucidasyna aralaşyp, ýumurtga membranasyna baglamak ukyby bardy, ýöne oosit membranasy bilen birleşip bilmedi.Öňki gözlegler, TMEM95-iň IZUMO133 bilen gurluş meňzeşligini paýlaşýandygyny görkezdi.Hakykatdanam, “AlphaFold” modeli, TMEM95-iň IZUMO1 we SPACA6 bilen birmeňzeş jübüt CXXC hereketlendirijisi we SPACA6-da tapylan 1-nji we 2-nji gabyklaryň arasyndaky birmeňzeş goşmaça disulfid baglanyşygydygyny tassyklady (3a we S11-nji surat).TMEM95-de Ig ýaly domen ýok bolsa-da, SPACA6 we IZUMO1 çeňňek sebitlerine meňzeş disulfid baglanyşyk nagşy bar (3-nji surat).Bu golýazma çap edilende, deslapky serwer, AlphaFold53 netijesini tassyklaýan TMEM95-iň gurluşyny habar berdi.TMEM95 SPACA6 we IZUMO1 bilen gaty meňzeýär we amfibiýalarda eýýäm ewolýusiýa taýdan saklanýar (4-nji surat we S13).
PSI-BLAST gözleginde bu yzygiderliligiň durmuş agajyndaky ornuny kesgitlemek üçin NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP we SOF1 maglumat bazalary ulanyldy.Şaha nokatlarynyň arasyndaky aralyklar masştabda görkezilmeýär.
SPACA6 bilen IZUMO1-iň arasyndaky umumy gurluş meňzeşligi, TMEM95 we IZUMO 2, 3 we 4 beloklary öz içine alýan konserwatiw gurluş maşgalasynyň esaslandyryjylaryny görkezýär.belli agzalar: IZUMO1, SPACA6 we TMEM95.Diňe az sanly agzanyň Ig ýaly domenleri barlygy sebäpli, IST superfamilyanyň alamaty, bu beloklaryň hemmesine mahsus aýratynlyklary bolan 4HB domenidir: 1) Paralel / paralel alternatiwada ýerleşdirilen gabyklar bilen örtülen 4HB (Surat) . 5a), 2) bukjanyň içinde iki sany gabykdan we üçünji dik geliçden ybarat üçburç ýüzi bar (5-nji surat). Tioredoksin ýaly beloklardan tapylan CXXC hereketi, belli. redoks datçigi hökmünde 54,55,56, IST maşgala agzalarynyň hereketi gamete birleşmeginde ERp57 ýaly belok disulfid izomerazlary bilen baglanyşykly bolup biler. Rollar 57,58 bilen baglanyşykly.
IST super maşgalanyň agzalary 4HB domeniniň üç häsiýetli aýratynlygy bilen kesgitlenýär: paralel we antiparallel ugruň arasynda üýtgeýän dört sany helelik, üçburçluk dikligine baglanan ýüzler we kiçi molekulalaryň arasynda emele gelen ca CXXC goşa hereket.) N terminaly gelixler (mämişi) we ilikli sebit β saçly (ýaşyl).
SPACA6 bilen IZUMO1 arasyndaky meňzeşligi göz öňünde tutup, öňküsiniň IZUMO1 ýa-da JUNO bilen baglanyşyk ukyby synag edildi.Biolaýer interferometri (BLI) kinetiki esasly baglanyşyk usuly bolup, öň IZUMO1 bilen JUNO-nyň arasyndaky täsirini bahalandyrmak üçin ulanylýar.Biotin bellikli datçigiň IZUMO1 bilen JUNO analitiginiň ýokary konsentrasiýasy bolan çeňňek hökmünde inkubasiýa edilenden soň, datçigiň ujuna berkidilen biomaterial galyňlygynyň hökmany üýtgemegini görkezýän güýçli signal tapyldy (S14a surat).Şuňa meňzeş signallar (ýagny, JUNO IZUMO1 analitigine garşy çeňňek hökmünde datçige birikdirildi) (S14b surat).SPACA6 sensor bilen baglanyşykly IZUMO1 ýa-da datçik bilen baglanyşykly JUNO garşy analitik hökmünde ulanylanda hiç hili signal tapylmady (S14a surat, b).Bu signalyň ýoklugy, SPACA6-dan daşary domeniň IZUMO1 ýa-da JUNO-dan daşary domen bilen täsirleşmeýändigini görkezýär.
BLI barlagy çeňňek belogynda erkin lizin galyndylarynyň biotinilýasiýasyna esaslanýandygy sebäpli, bu üýtgetme, lizin galyndylary özara täsirleşýän bolsa, baglanyşygyň öňüni alyp biler.Mundan başga-da, baglanyşygyň datçige gönükdirilmegi steriki päsgelçilikleri döredip biler, şonuň üçin SPACA6, IZUMO1 we JUNO ektodomainlerinde rekombinantda adaty çekiş barlaglary geçirildi.Muňa garamazdan, SPACA6 bellikli IZUMO1 ýa-da bellikli JUNO (S14c surat, d) bilen çökmedi, bu BLI synaglarynda gabat gelýän hiç hili täsiriň ýokdugyny görkezýär.Oňyn gözegçilik hökmünde JUNO-nyň “IZUMO1” (S14e we S15 suratlar) belgisi bilen özara täsirini tassykladyk.
SPACA6 bilen IZUMO1 arasyndaky gurluş meňzeşligine garamazdan, SPACA6-nyň JUNO-ny baglap bilmezligi geň däldir.Adam IZUMO1-iň üstünde JUNO bilen täsirleşýän 20-den gowrak galyndy bar, şol sanda üç sebitiň hersiniň galyndylary (köpüsi çeňňek sebitinde bolsa-da) (S14f surat).Bu galyndylardan diňe biri SPACA6-da (Glu70) saklanýar.Köp galyndy çalyşmalary asyl biohimiki aýratynlyklaryny saklap galsa-da, IZUMO1-de esasy Arg160 galyndy SPACA6-da negatiw zarýadly Asp148 bilen çalşyryldy;Öňki gözlegler, IZUMO1-de Arg160Glu mutasiýa, JUNO43 bilen baglanyşygy düýbünden diýen ýaly ýatyrýandygyny görkezdi.Mundan başga-da, IZUMO1 bilen SPACA6 arasyndaky domen ugrunyň tapawudy, SPACA6-da ekwiwalent sebitiň JUNO baglaýjy ýeriniň üstki meýdanyny ep-esli ýokarlandyrdy (S14g surat).
Gamete birleşmek üçin SPACA6 zerurlygyna we IZUMO1 bilen meňzeşligine garamazdan, SPACA6 ekwiwalent JUNO baglanyşyk funksiýasyna meňzemeýär.Şonuň üçin gurluş maglumatlarymyzy ewolýusiýa biologiýasy tarapyndan berlen ähmiýetiň subutnamasy bilen birleşdirmäge synanyşdyk.SPACA6 gomologlarynyň yzygiderliligi süýdemdirijilerden başga umumy gurluşyň saklanýandygyny görkezýär.Mysal üçin, sistiniň galyndylary uzakdan baglanyşykly amfibiýalarda-da bar (6a surat).ConSurf serwerini ulanyp, SPACA6 ýüzüne 66 yzygiderliligiň köp yzygiderliligini saklamak maglumatlary kartalaşdyryldy.Derňewiň bu görnüşi, belok ewolýusiýasy wagtynda haýsy galyndylaryň saklanandygyny we haýsy ýerüsti sebitleriň işleýşinde rol oýnaýandygyny görkezip biler.
CLUSTAL OMEGA ulanyp taýýarlanan 12 dürli görnüşden SPACA6 ektodomainleriň yzygiderliligi.ConSurf derňewine görä, iň konserwatiw pozisiýalar gök reňkde bellendi.Sistein galyndylary gyzyl reňkde görkezilýär.Domen araçäkleri we ikinji derejeli gurluş elementleri deňlemäniň ýokarsynda görkezilýär, bu ýerde oklar β setirleri we tolkunlar helelleri görkezýär.Yzygiderliligi öz içine alýan NCBI giriş kesgitleýjileri: adam (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapuçin maýmyn (Cebus mimic, XP_017359366), at (Equus caballus, XP_02350610 34).), goýunlar (Ovis aries, XP_014955560), pil (Loxodonta africana, XP_010585293), it (Canis lupus familyis, XP_025277208), syçan (Mus musculus, NP_001156381), Tasman şeýtany (Sarcophilus X_03) , 61_89 we Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Sanlamak adam tertibine esaslanýar.b theokarda 4HB we aşaky böleginde Ig ýaly domen bolan SPACA6 gurluşynyň daşky görnüşi, ConSurf serweriniň gorap saklamalaryna esaslanýan reňkler.Iň oňat goralýan bölekler gök reňkde, ortaça saklanylýan bölekler ak reňkde, iň az saklanan bölekleri bolsa sary reňkde.gyrmyzy sistein.Protectionokary derejeli goragy görkezýän üç sany ýerüsti ýamalar, 1, 2 we 3 belgili ýazgylarda görkezilýär. 4HB multfilmi ýokarky sag tarapdaky ýazgyda görkezilýär (şol bir reňk shemasy).
SPACA6 gurluşynda ýokary derejede goralýan üç sebit bar (6-njy surat).Patch 1 4HB we çeňňek sebitini öz içine alýar we iki sany konserwirlenen CXXC disulfid köprüsini, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 çeňňek toruny (S7-nji surat) we üç sany konserwirlenen daşarky ysly galyndylary (Phe31, Tyr73, Phe137) öz içine alýar.Spermiň üstündäki birnäçe pololyitel zarýadly galyndylary görkezýän Ig ýaly domeniň has giň bölegi (S6e surat).Gyzykly tarapy, bu ýamanyň öň SPACA6 30 işine päsgel berýändigi görkezilen antikor epitopy bar.3-nji sebit, çeňňegi we Ig ýaly domeniň bir tarapyny öz içine alýar;bu sebitde konserwirlenen prolinler (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) we daşarky polýar / zarýadly galyndylar bar.Geň zat, 4HB üstündäki galyndylaryň köpüsi ýokary üýtgeýär (6b-nji surat), bu bukja SPACA6 gomologynyň hemme ýerinde (gidrofobiki bukjanyň konserwatiwiniň görkezişi ýaly) we IST superfamilyanyň daşynda saklanýar.
Iň az kesgitlenýän ikinji derejeli gurluş elementleri bolan SPACA6-da iň kiçi sebit bolsa-da, köp sanly sebit galyndylary (3-nji sebiti hem goşmak bilen) SPACA6 gomologlarynyň arasynda ýokary derejede saklanýar, bu bolsa dik bukjanyň we sand-sendwiçiň ugrunyň möhümdigini görkezip biler.konserwatiw hökmünde.Şeýle-de bolsa, SPACA6 we IZUMO1 çeňňek sebitinde giň wodorod baglanyşygyna we elektrostatik torlara garamazdan, IZUMO137,43,44 köp rugsat berlen gurluşlaryň deňleşmeginde içerki çeýeligiň subutnamasyny görmek bolýar.Aýry-aýry domenleriň deňleşdirilmegi gowy gabat gelýär, ýöne domenleriň biri-birine bolan ugry merkezi okdan 50 ° 70 ° aralygynda üýtgeýärdi (S16-njy surat).SPACA6 çözgüdiň sazlaşykly dinamikasyna düşünmek üçin SAXS synaglary geçirildi (S17a, b).SPACA6 ektodomainiň ab initio rekonstruksiýasy hasanyň kristal gurluşyna laýyk gelýär (S18-nji surat), emma Kratkiniň sýu ploteti belli bir derejede çeýeligi görkezdi (S17b surat).Bu üýtgeşiklik, IZUMO1 bilen gapma-garşy gelýär, onda birleşdirilmedik belok panjarada-da, erginde-de bumerang görnüşini göz öňünde tutýar43.
Çeýe sebiti anyk kesgitlemek üçin SPACA6-da wodorod-deýteriý alyş-çalyş köpçülik spektroskopiýasy (H-DXMS) geçirildi we öň IZUMO143-de alnan maglumatlar bilen deňeşdirildi (7a surat, b).SPACA6 IZUMO1-den has çeýe, 100,000 s alyş-çalyşdan soň gurluşyň hemme ýerinde has ýokary deýteriý alyş-çalşygynyň görkezişi ýaly.Iki gurluşda-da, halka sebitiniň C terminaly bölegi ýokary alyş-çalyş derejesini görkezýär, bu bolsa 4HB we Ig ýaly domenleriň biri-birine görä çäkli aýlanmagyna mümkinçilik döredýär.Gyzykly tarapy, 147CDLPLDCP154 galyndysyndan ybarat SPACA6 çeňňegiň C terminaly bölegi, ýokary derejede goralýan sebit 3 (6b surat), bu aralyk çeýeligiň SPACA6-nyň ewolýusiýa taýdan goralýan aýratynlygydygyny görkezýär.Çeýeligiň derňewine görä, CD termiki eremegiň maglumatlary SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) -den has durnuklydygyny görkezdi (S1e we S19 surat).
SPACA6 we b IZUMO1-iň H-DXMS şekilleri.Göterim deýteriý çalşygy görkezilen wagt nokatlarynda kesgitlenildi.Wodorod-deýteriý çalşygynyň derejeleri gök (10%) -den gyzyl (90%) gradient şkalada reňk bilen görkezilýär.Gara gutular ýokary alyş-çalyş ýerlerini görkezýär.Kristal gurluşda syn edilýän 4HB, ilik we Ig ýaly domeniň araçäkleri esasy yzygiderliligiň üstünde görkezilýär.10 s, 1000 s we 100,000 s aralygyndaky deýteriý alyş-çalyş derejeleri, SPACA6 we IZUMO1-iň aýdyň molekulýar ýüzleriniň üstünde goýlan zolak diagrammasynda meýilleşdirildi.Deuteriý alyş-çalyş derejesi 50% -den pes bolan gurluşlaryň bölekleri ak reňkli.50% H-DXMS alyş-çalşygy gradient şkalasynda reňklenýär.
CRISPR / Cas9 we syçan geniniň nokaut genetiki strategiýalarynyň ulanylmagy, sperma we ýumurtga baglanyşygy we birleşmegi üçin möhüm birnäçe faktoryň kesgitlenmegine sebäp boldy.IZUMO1-JUNO we CD9 gurluşynyň gowy häsiýetlendirilen özara täsirinden başga-da, gamete birleşmegi bilen baglanyşykly beloklaryň köpüsi gurluş we funksional taýdan täsirli bolup galýar.SPACA6-nyň biofiziki we gurluş häsiýetnamasy tohumlandyrylmada ýelmeýän / birleşýän molekulýar tapmanyň başga bir bölegi.
SPACA6 we IST maşgalasynyň beýleki agzalary süýdemdirijilerde, aýratyn guşlarda, süýrenijilerde we ýerde-suwda ýaşaýanlarda ýokary derejede goralana meňzeýär;aslynda, zebrafiş 59-da tohumlandyrmak üçin SPACA6 zerur diýlip hasaplanýar. Bu paýlanyş, bu faktorlaryň HAP2 ýetmezçiligini görkezýän DCST134, DCST234, FIMP31 we SOF132 ýaly belli gamete birleşmek bilen baglanyşykly beloklara meňzeýär. GCS1 diýlip atlandyrylýar) köp sanly protestçiniň katalitiki işjeňligi üçin jogapkär beloklar., ösümlikler we artropodlar.Tohumlandyrylan birleşme beloklary 60, 61. SPACA6 bilen IZUMO1 arasynda güýçli gurluş meňzeşligine garamazdan, bu beloklaryň ikisini kodlaýan genleriň kakylmagy, erkek syçanlarda önelgesizlige sebäp bolup, gamete birleşmegindäki funksiýalarynyň gaýtalanmaýandygyny görkezýär..Has giňişleýin aýdylanda, birleşmegiň ýelme fazasy üçin zerur bolan belli sperma beloklarynyň hiç biri-de artykmaç däl.
SPACA6 (we IST super maşgalasynyň beýleki agzalary) intergametiki çatryklara gatnaşýarmy, birleşýän nokatlara möhüm beloklary çekmek üçin içerki ulgamlary döredýärmi ýa-da hatda düşnüksiz fusogenler hökmünde hereket edýärmi açyk sorag bolup galýar.HEK293T öýjüklerinde bilelikde immunopripsitasiýa gözlegleri, doly uzynlykdaky IZUMO1 we SPACA632 arasyndaky täsirini ýüze çykardy.Şeýle-de bolsa, rekombinant ektodomainlerimiz vitro bilen täsirleşmedi, bu Noda we ş.m.ikisi hem konstruksiýada öçürildi (tohumlandyrmagyň zerur däldigi görkezilen IZUMO1 sitoplazmatik guýrugyna üns beriň62).Ativea-da bolmasa, IZUMO1 we / ýa-da SPACA6, vitroda köpeltmeýän, fiziologiki taýdan aýratyn sazlaşyklar ýa-da beýleki beloklary öz içine alýan molekulýar toplumlar (belli ýa-da entek açylmadyk) ýaly hökmany şertleri talap edip biler.IZUMO1 ektodomainiň spermatozoidiň perivitellin giňişliginde ýumurtga birikdirilmegine araçylyk edýändigine ynanýan hem bolsa, SPACA6 ektodomainiň maksady belli däl.
SPACA6-nyň gurluşy, belok-belok täsirine gatnaşyp bilýän birnäçe konserwirlenen ýüzleri ýüze çykarýar.Çeňňek sebtiniň konserwirlenen böleginde derrew CXXC motifine ýanaşyk (ýokarda 1-nji patch bellendi) birnäçe daşarky ýüzli ysly galyndylar bar, olar köplenç biomolekulalaryň arasynda gidrofob we π berkitme täsirleri bilen baglanyşykly.Ig ýaly domeniň (2-nji sebit) giň taraplary ýokary derejede goralýan Arg we onuň galyndylary bilen pololyitel zarýadly çukur emele getirýär we bu sebite garşy antikorlar öň gamete 30 birleşmeginiň öňüni almak üçin ulanylýar.Antikor alty sany argin galyndysynyň üçüsine eýe bolan we His220-ni ýokary derejede saklaýan 212RIRPAQLTHRGTFS225 çyzykly epitopy ykrar edýär.Disfunksiýanyň bu aýratyn galyndylaryň ýa-da tutuş sebitiň petiklenmegi bilen baglanyşyklydygy belli däl.Bu boşlugyň C-sandwiçiň C terminalynyň golaýynda ýerleşmegi, goňşy sperma beloklary bilen özara täsirini görkezýär, ýöne oosit beloklary bilen däl.Mundan başga-da, ýokary çeýe proline baý tangeliň (3-nji sahypa) çeňňegiň içinde saklanmagy, belok bilen beloklaryň özara täsirleşýän ýeri bolup biler ýa-da iki domeniň arasynda çeýeligiň saklanmagyny görkezýär.Jyns, SPACA6-nyň näbelli roly üçin möhümdir.gametleriň birleşmegi.
SPACA6, öýjükli ýelimlenýän beloklaryň, şol sanda Ig ýaly sand-sandwiçleriň häsiýetlerine eýedir.Köp ýelimleýji beloklar (mysal üçin, kaderinler, integrinler, ýelimler we IZUMO1) öýjük membranasyndan beloklary daşky gurşaw maksatlaryna çenli uzaldýan bir ýa-da birnäçe sand-sandwiç domenine eýe 63,64,65.SPACA6-nyň Ig ýaly domeni, adatça, ýelmeşmegiň we birleşmegiň sand-sandwiçlerinde duş gelýän bir sebäbini öz içine alýar: mehaniki gysgyçlar diýlip atlandyrylýan sand-sandwiçleriň ujundaky paralel çyzyklaryň iki esse.Bu hereket, öýjükli täsirlere gatnaşýan beloklar üçin gymmatly gyrkym güýçlerine garşylygy ýokarlandyrýar diýip hasaplanýar.Şeýle-de bolsa, ýelimlere meňzeşligine garamazdan, häzirki wagtda SPACA6-nyň ýumurtga aklary bilen täsirleşýändigi barada hiç hili subutnama ýok.SPACA6 ektodomain JUNO bilen baglanyşyp bilmeýär we bu ýerde görkezilişi ýaly SPACA6 aňladýan HEK293T öýjükleri 32 zona ýetmezçiligi bolan oositler bilen täsirleşip bilmeýär.SPACA6 intergametiki baglanyşyklary döredýän bolsa, bu özara täsirler terjimeden soňky üýtgeşmeleri ýa-da beýleki sperma beloklary tarapyndan durnuklaşdyrylmagyny talap edip biler.Soňky çaklamany goldamak üçin, IZUMO1 ýetmezçilikli spermatozoa oositler bilen baglanyşdyrylýar, 27-nji gamete ýelmeşme ädimine IZUMO1-den başga molekulalaryň gatnaşýandygyny görkezýär.
Wirusly, öýjükli we ösüş birleşýän beloklaryň köpüsi, fusogenler ýaly işini çaklaýan häsiýetlere eýe.Mysal üçin, wirusly birleşme glikoproteinleri (I, II we III synplar) kabul ediji membrana salynýan belogyň soňunda gidrofob birleşme peptidi ýa-da aýlawy bar.IZUMO143-iň gidrofil kartasy we IST super maşgalasynyň gurluşy (kesgitlenen we çaklanylýan) gidrofob birleşme peptidini görkezmedi.Şeýlelik bilen, IST superfamilyadaky haýsydyr bir belok fusogen hökmünde işleýän bolsa, beýleki belli mysallardan tapawutly görnüşde edýärler.
Sözümiň ahyrynda, gamete birleşmegi bilen baglanyşykly beloklaryň köp maşgalasynyň IST agzalarynyň wezipeleri bir täsin syr bolup galýar.Biziň häsiýetlendirilen SPACA6 rekombinant molekulasy we çözülen gurluşy, bu umumy gurluşlaryň arasyndaky gatnaşyklar we gamete goşulmagy we birleşmegindäki roly barada düşünje berer.
Göz öňünde tutulan adam SPACA6 ektodomaine (NCBI goşulma belgisi NP_001303901.1; galyndylar 27–246) laýyk gelýän DNK yzygiderliligi, Drosophila melanogaster S2 öýjüklerinde aňlatmak üçin kodlaşdyryldy we Kozak (Eurofins Genomics) yzygiderliligi bilen gen bölegi hökmünde sintez edildi., BiP sekresiýa signaly we degişli 5 ′ we 3 ′ bu geniň pMT aňlatma wektoryna puromisin (pMT-puro) bilen saýlamak üçin üýtgedilen metallothionein promouterine esaslanýan klonlaşdyrylmagy üçin gutarýar.PMT-puro wektory, 10x-His C terminaly belligi bilen trombiniň ýarylýan ýerini kodlaýar (S2-nji surat).
SPACA6 pMT-puro wektorynyň D. melanogaster S2 (Gibco) öýjüklerine durnukly geçirilmegi IZUMO1 we JUNO43 üçin ulanylýan protokola meňzeş ýerine ýetirildi.S2 öýjükleri eredildi we Schneider-iň (Gibco) ösümliginde 10% (v / v) ýylylyk hereketsiz düwünçegiň göle serumu (Gibco) we 1X antimikotik antibiotik (Gibco) bilen dolduryldy.Irki geçiş öýjükleri (3.0 x 106 öýjük) 6 guýy tarelkanyň aýry guýularyna örtüldi (Corning).27 ° C-de 24 sagat inkubasiýa edilenden soň, öýjükler öndürijiniň teswirnamasyna laýyklykda 2 mg SPACA6 pMT-puro wektorynyň we Effektin transfeksiýa reagentiniň (Qiagen) garyndysy bilen transfeksiýa edildi.Geçirilen öýjükler 72 sagatlap inkubasiýa edildi, soň bolsa 6 mg / ml puromisin bilen ýygnaldy.Öýjükler soňra Schneider-iň doly gurşawyndan izolirlenip, uly mukdarda belok öndürmek üçin serumsyz Mör-möjek-XPRESS gurşawyna (Lonza) ýerleşdirildi.S2 öýjük medeniýetiniň 1 L topary, 2 L şemalladylýan tekiz polipropilen Erlenmeýer çüýşesinde 8-10 × 106 ml-1 öýjükde ösdürilip ýetişdirildi we soňra 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) konsentrasiýasy bilen sterilizasiýa edildi we steril süzüldi.öjükdirilen.Döredilen medeniýetler 27 ° C-de 120 aýlawda dört gün inkubasiýa edildi.
SPACA6-ny öz içine alýan şertli gurşaw, 5 ° C-den 5660 × g sentrifugasiýa bilen izolýasiýa edildi, soňra 10 kDa MWCO membranasy bolan Centramate tangensial akym süzgüç ulgamy (Pall Corp).SPACA6 bolan konsentrirlenen serişdäni 2 ml Ni-NTA agarose rezin (Qiagen) sütünine ulanyň.Ni-NTA rezini A buferiň 10 sütün göwrümi (CV) bilen ýuwuldy, soň bolsa 50 mM imidazolyň konsentrasiýasyny bermek üçin 1 CV bufer goşuldy.SPACA6 10 ml bufer bilen çykaryldy, imidazol bilen 500 m iň soňky konsentrasiýasyna goşuldy.Çäklendiriji synp trombini (Millipore Sigma), dializ turbalaryna (MWCO 12-14 kDa) SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 we 150 mM NaCl (bufer B) goşuldy.) 4 ° C-den 48 sagatlap.Trombin bilen ýapylan SPACA6 soňra duzuň konsentrasiýasyny azaltmak üçin üç esse suwuklandyryldy we 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 bilen deňleşdirilen 1 ml MonoS 5/50 GL kation alyş-çalyş sütünine (Cytiva / GE) ýüklendi.Kation çalşyjy 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 bilen ýuwuldy, soňra SPACA6 0 mm-den 500 mm NaCl çenli 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 üçin 25 OK üçin çyzykly gradiýent bilen uzaldyldy.Ion çalşygy hromatografiýasyndan soň, SPACA6 1 ml jemlenip, B buferi bilen deňleşdirilen EN6 SEC650 10 x 300 sütüninden (BioRad) izokratik usulda çykaryldy, hromatogramma, howuz we SPACA6 bolan konsentrat fraksiýalaryna görä.Arassalygy 16% SDS-poliakrilamid jelinde Coomassie reňkli elektroforez bilen dolandyrylýar.Beloklaryň konsentrasiýasy, Beer-Lambert kanuny we teoretiki molar ýok bolmak koeffisiýenti bilen 280 nm sorulma bilen kesgitlenildi.
Arassalanan SPACA6 bir gije 10 m natriý fosfat, pH 7.4 we 150 mM NaF garşy dializ edildi we CD spektroskopiýa seljermesinden öň 0,16 mg / ml çenli suwuklandyryldy.Tolkun uzynlygy 185-den 260 nm bolan CD-leriň spektral skaneri, Jasco J-1500 spektropolarimetrinde 1 mm optiki ýol uzynlygy (Helma) 25 ° C-den 50 nm / min tizlik bilen kwars kuwwatlaryny ulanyp ýygnaldy.CD spektrleri esasy düzedildi, ortaça 10-dan gowrak gazanyldy we cm2 / dmol derejesinde galyndy elliptiklige (θMRE) öwrüldi:
bu ýerde MW Da-da her nusganyň molekulýar agramy;N aminokislotalaryň sany;mill millidegreelerde elliptiklikdir;d sm optiki ýoluň uzynlygyna laýyk gelýär;birliklerde belok konsentrasiýasy.