347 12.7 * 1,24mm Poslamaýan polatdan ýasalan turbalar, sinhron elektrostatik kondensasiýanyň molekulýar mehanizmi we α-sinuklein we tau birleşmegi

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.

347 Poslamaýan polat turbanyň spesifikasiýasy

347 12.7 * 1,24mm Poslamaýan polatdan ýasalan turbalar

Daşarky diametri: 614 mm OD 914,4 mm OD, ululygy 24 "NB çenli Ex-stock, OD Size Polat Turbalar Ex-stock

SS 347 Turbanyň galyňlygy aralygy: 0,3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S we ş.m. (0,5-12mm) Ora-da talap edilişi ýaly düzülmeli adaty däl ululyk

Görnüşi: SS 347 bökdençsiz turbalar |SS 347 ERW turbalary |SS 347 Kebşirlenen turbalar |SS 347 öndürilen turbalar |SS 347 CDW turbalary, LSAW turbalary / Kebşirlenen / gaýtadan çekilen

Formasy: SS 347 tegelek turbalar / turbalar, SS 347 inedördül turbalar / turbalar, SS 347 gönüburçly turbalar / turbalar, SS 347 örtülen turbalar, SS 347 “U” şekilli, SS 347 pan tortlary, SS 347 gidrawlik turbalar

Uzynlygy: Randomeke-täk tötänleýin, goşa tötänleýin we zerur uzynlyk ahyry: Düz uç, kesilen uç, aýakly

Ahyrky gorag: Plastiki gapaklar |Daşarda gutarmak: 2B, .44, .11, .8 Poslamaýan polat turbalar üçin aýna bezegi, müşderiniň talaplaryna görä tamamlaň

Eltip bermegiň ýagdaýy: dykylan we duzlanan, ýalpyldawuk, açyk örtülen, sowuk çyzylan

Barlag, synag hasabatlary: degirmen synag şahadatnamalary, EN 10204 3.1, himiki hasabatlar, mehaniki hasabatlar, PMI synag hasabatlary, wizual barlag hasabatlary, üçünji tarap barlag hasabatlary, NABL tassyklanan laboratoriýa hasabatlary, weýran ediji synag hasabaty, weýran ediji synag hasabatlary

Gaplamak: Agaç gutularda, plastik haltalarda, polat zolaklarda ýa-da müşderileriň isleglerine görä gaplanýar.

Hünärmenler: aboveokardakylardan başga ululyklar we aýratynlyklar isleg boýunça öndürilip bilner

SS 347 Turbanyň ululygy: 1/2 dýuým NB, OD-dan 24 dýuýma

ASTM A312 347: temperatureokary temperatura we umumy poslaýjy hyzmat üçin niýetlenen bökdençsiz we göni tikilen kebşirlenen austenit turbasy.Kebşirleýiş wagtynda doldurgyç metal rugsat berilmeýär.

ASTM A358 347: Elektrik birleşmesi poslaýjy we / ýa-da ýokary temperatura hyzmaty üçin austenit turbany kebşirledi.Adatça bu spesifikasiýa üçin diňe 8 dýuýma çenli turba öndürilýär.Kebşirleýiş wagtynda doldurgyç metal goşmaga rugsat berilýär.

ASTM A790 347: Umumy poslama hyzmat etmek üçin niýetlenen bökdençsiz we göni tikilen kebşirlenen ferrit / austenit (dupleks) turba, stres poslama döwülmegine garşylyga aýratyn üns berýär.

ASTM A409 347: Göni ýa-da spiral tikişli elektrik birleşmesi, poslaýjy we / ýa-da beýik üçin Sch5S we Sch 10S diwarlary bilen 14 "30" ululykdaky uly diametrli austenit ýagty diwar turbasy bilen kebşirlendi

ASTM A376 347: temperatureokary temperaturaly programmalar üçin üznüksiz austenit turba.

ASTM A813 347: temperatureokary temperatura we umumy poslaýjy goşundylar üçin bir tikişli, bir ýa-da iki kebşirlenen austenit turbasy.

ASTM A814 347: temperatureokary temperatura we umumy poslaýjy hyzmat üçin sowuk işleýän kebşirlenen austenit turbasy.

347H Poslamaýan polat turbalaryň himiki düzümi

Poslamaýan polat 347H Turbanyň mehaniki aýratynlyklary

Poslamaýan polat 347H turbalaryň fiziki aýratynlyklary

347H poslamaýan polat turbasy üçin ekwiwalent bahalar

Amiloid alfa-sinuklein (αS) birleşmesi Parkinson keseliniň we beýleki sinukleinopatiýalaryň alamatydyr.Recentlyaňy-ýakynda Alsgeýmer keseli bilen baglanyşykly tau belogy αS patologiýasy bilen baglanyşykly bolup, iki belokyň birleşmeginiň molekulýar mehanizmi düşnüksiz bolsa-da, αS baý goşulmalarda bilelikde lokalizasiýa edilip tapyldy.Bu ýerde αS fazasynyň tau ýaly pololyitel polipeptidler bilen elektrostatiki çylşyrymly kondensasiýa arkaly suwuk kondensatlara bölünýändigini habar berýäris.Polikasiýa üçin αS-iň ýakynlygyna we koagulýasiýa ulgamynyň walentiň azalmagynyň tizligine baglylykda, paltalar çalt jelasiýa ýa-da birleşýär, soň bolsa haýal amiloid agregasiýasy bolýar.Öňdebaryjy biofiziki usullar toplumyny birleşdirip, suwuk-suwuk αS / Tau fazasynyň bölünişini häsiýetlendirip bildik we suwuk belok kondensatynda iki belogy öz içine alýan birmeňzeş agregatlaryň döremegine sebäp bolýan esasy faktorlary kesgitledik.
Membrananyň böleklerinden başga-da, öýjüklerde giňişlikde bölünişik, suwuk-suwuk fazanyň bölünişi (LLPS) diýlip atlandyrylýan proses arkaly, biomolekulýar kondensatlar ýa-da damjalar diýlip atlandyrylýan beloklara baý, suwuk ýaly dykyz jisimleriň emele gelmegi bilen gazanylyp bilner.Bu damjalar, köplenç beloklaryň ýa-da beloklaryň we RNK-nyň arasynda köp wagtlaýyn täsirleşmeler arkaly emele gelýär we ähli ýaşaýyş ulgamlarynda diýen ýaly dürli funksiýalara hyzmat edýär.LLP-e ukyply beloklaryň köpüsi, tebigatda we biomolekulýar kondensatlaryň emele gelmeginde pes çylşyrymlylygyň yzygiderliligini görkezýär.Köp sanly synag synaglary bu suwuk kondensatlary emele getirýän beloklaryň çeýe, köplenç tertipsiz we köpugurly tebigatyny ýüze çykardy, ýöne bu kondensatlaryň ösmegine we ýetişmegine gözegçilik edýän belli bir molekulýar kesgitleýjiler hakda az zat bilinýär. ýagdaýy..
Täze maglumatlar, belok bilen dolandyrylýan LLPS we damjalaryň gaty gurluşlara öwrülmegi, köplenç degeneratiw keselleriň alamaty bolan eräp bolmaýan zäherli agregatlaryň döremegine sebäp bolýan öýjükli ýollar bolup biler diýen çaklamany goldaýar.Köplenç ýokary zarýadly we çeýe LLPS bilen baglanyşykly içerki bozulan beloklar (IDP), uzak wagtlap amiloid agregasiýasy arkaly newrodegenerasiýa bilen baglanyşyklydyr.Hususan-da, FUS7 ýa-da TDP-438 ýaly biomolekulýar IDP kondensatlary ýa-da hnRNPA19 ýaly uly pes çylşyrymly domenlere eýe bolan beloklar, suwuklyk diýilýän proses arkaly jele meňzeş ýa-da gaty görnüşlere öwrülendigi görkezildi.birleşme.berk funksiýa geçişine (LSPT) wagtyň funksiýasy hökmünde ýa-da käbir terjimeden soňky üýtgeşmelere ýa-da patologiki taýdan möhüm mutasiýalara jogap hökmünde1,7.
“Vivo in LLPS” bilen baglanyşykly başga bir IDP, amiloidiň birleşmegi Alsgeýmer keseline täsir eden, ýöne Parkinson keseline (PD) we 11, 12, 13 beýleki sinaptiki ýadro proteinopatiýalary bilen baglanyşykly mikrotubula bagly tertipsiz belok Tau.Tau, amatly elektrostatik täsirleşmeler sebäpli ergin / sitoplazmadan öz-özünden aýrylýandygyny görkezdi14, netijede elektrostatik koakerwatlar diýlip atlandyrylýan tau bilen baýlaşdyrylan damjalaryň döremegine sebäp boldy.Aýratyn däl täsiriň bu görnüşiniň tebigatda köp biomolekulýar kondensatlaryň hereketlendiriji güýji bolandygy hem syn edildi15.Tau belogy bolan ýagdaýynda, elektrostatik agregasiýa ýönekeý agregasiýa arkaly emele gelip biler, onda belokyň garşy zarýadly sebitleri ýarylma prosesine itergi berer ýa-da RNK ýaly negatiw zarýadly polimerler bilen täsirleşmek arkaly çylşyrymly agregasiýa arkaly emele gelip biler.
Recentlyakynda, sinukleinopatiýa 17,18 diýlip atlandyrylýan PD we beýleki newrodegeneratiw kesellerde ýüze çykarylan amiloid IDP α-sinuklein (αS), öýjükli we haýwan modellerinde 19,20 suwuklyga meňzeş hereket bilen belok kondensatlarynda jemlenendir.In vitro gözlegler, esasan gidrofobiki täsirleşmeler arkaly αS-iň ýönekeý birleşmek arkaly LLPS-den geçýändigini görkezdi, ýöne bu amal gaty ýokary belok konsentrasiýasyny we adaty uzak inkubasiýa wagtyny talap edýär19,21.“Vivo” -de syn edilýän αS öz içine alýan kondensatlaryň şu ýa-da beýleki LLPS amallaryndan emele gelendigi esasy çözülmedik mesele bolup galýar.Edil şonuň ýaly-da, PD we beýleki sinukleinopatiýalarda neýronlarda αS amiloid birleşmesiniň bardygyna garamazdan, αS öýjükli amiloid agregasiýasynyň takyk mehanizmi düşnüksiz bolup galýar, sebäbi bu belogyň aşa aşa gysylmagy bu prosese sebäp bolmaýar.Öýjükli αS amiloid gurnamalarynyň üýtgemegi üçin belli bir öýjükli ýerleriň ýa-da mikro-gurşawyň zerurdygyny görkezýän goşmaça öýjükli zeper talap edilýär.Aýratynam ýygnanmaga meýilli bir öýjükli gurşaw, belok kondensatlarynyň içki bölegi bolup biler 23.
Gyzykly tarapy, Parkinson we beýleki sinukleinopatiýa keseli bolan adamlarda häsiýetli keselleriň goşulmagynda αS we tau 24,25 tapyldy we synaglar iki belokyň arasynda 26,27 sinergistik patologiki arabaglanyşygy habar berdi, αS we agregasiýa arasynda bolup biljek baglanyşygy görkezýär. newrodegeneratiw kesellerde.kesel.αS we tau vitro we wivo 28,29-da biri-biriniň birleşmegini we öňe sürülmegi üçin tapyldy we sinukleinopatiýa 30 bolan näsaglaryň beýnisinde bu iki belokdan ybarat birmeňzeş agregatlar hasaba alyndy.Şeýle-de bolsa, αS bilen tau-nyň özara täsiriniň molekulýar esaslary we birleşmegiň mehanizmi barada az zat bilinýär.αS-nyň ýokary negatiw zarýadly C terminaly sebiti bilen merkezi proline baý tau sebitiniň arasynda elektrostatiki çekiş arkaly tau bilen täsirleşýändigi habar berildi, bu hem pololyitel zarýadly galyndylar bilen baýlaşdyryldy.
Bu gözlegimizde, poli-L-lizin (pLK) ýaly beýleki oňyn zarýadly polipeptidler bilen täsirinden tapawutlylykda we tau belogynyň barlygynda elektrostatiki çylşyrymly kondensasiýa arkaly damjalara bölünip biljekdigini görkezýäris.αS damja ulgamy üçin skaf molekulasy hökmünde çykyş edýär.Elektrostatik αS koakerwatlaryň kämillik döwründe ep-esli tapawutlary kesgitledik, bu koakerwat toruna gatnaşýan beloklaryň täsiriniň bahasynyň we güýjüniň tapawudy bilen baglanyşykly.Gyzykly tarapy, uzak ömürli suwuk koakerwatorlarda αS we tau amiloid beloklarynyň birleşmegini gördük we bu iki belokyň şeýle koakerwatlarda birleşmegine sebäp bolýan käbir möhüm faktorlary kesgitledik.Bu ýerde kesele mahsus bolan iki belokyň kolokalizasiýasynyň esasy bolup biljek molekulýar mehanizm bolan bu prosesi jikme-jik beýan edýäris.
neutralS bitarap pH-de ýokary anion C terminaly guýrugy bar (1a surat) we polikasiýa bozulan polipeptid molekulalary bilen elektrostatiki toplumlaryň kondensasiýasy arkaly LLPS-den geçip biljekdigini çakladyk.Neytral pH 32-de pololyitel pololyitel polo positiveitel zarýadly we tertipsiz bolandygy sebäpli başlangyç galyndy molekulasy hökmünde 100 galyndy poli-L-lizini (pLK) ulandyk. Ilki bilen, pLK NMR spektroskopiýasy arkaly αS Ct domeni bilen täsirleşýändigini tassykladyk. (1b surat) artýan αS: pLK molar gatnaşygy bar bolan ýagdaýynda 13C / 15N belgili αS ulanyp.PLK-nyň Ct-domeni bilen αS-iň täsiri himiki üýtgeşmäniň perturbasiýalarynda we belogyň bu sebitinde iň ýokary intensiwligiň peselmeginde ýüze çykýar.Gyzykly ýeri, αS konsentrasiýasynda αS-ni pLK bilen garyşdyranymyzda.Polietilen glikol (5–15% PEG-8) bar bolan 5–25 µM (adaty LLPS buferi: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) derrew belok emele gelişiniň giň meýdanyndan geçdik. .damjalar floresan (WF) we ýagty meýdan (BF) mikroskopiýasy arkaly syn edildi (1-nji surat).Konsentrirlenen αS (1 µM AlexaFluor488 belgili αS, AF488-αS goşuldy) öz içine alýan 1-5 µm damjalar, olaryň elektrostatiki aýratynlyklary 10% 1,6-heksanediol (1,6-HD) garşylygyndan we duýgurlygyndan alynyp bilner. NaCl konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy (1-nji surat).SS / pLK elektrostatiki toplumyň koakerwatlarynyň suwuklyga meňzeş tebigaty millisekuntda birleşmek ukyby bilen görkezilýär (1-nji surat).Turbidimetriýany ulanyp, bu şertlerde damjalaryň emele gelşini kesgitledik, durnuklylygy bilen baglanyşykly esasy täsiriň elektrostatiki häsiýetini tassykladyk (1e surat) we dürli polimer gatnaşyklarynyň LLPS prosesine edýän täsirine baha berdik (1-nji surat).Damjalaryň emele gelmegi polimer gatnaşyklarynyň giň toparynda syn edilse-de, pLK αS-den ýokary bolanda bu proses örän amatlydyr.Şeýle hem LLP-ler himiki taýdan üýtgeýän süýşüriji dextran-70 (70 kDa) ýa-da aýna slaýd damjalary, dürli materiallaryň mikroplat guýulary, Eppendorf ýa-da kwars kapilýallary ýaly dürli nusga formatlaryny ulanmakda syn edildi.
Bu gözlegde ulanylýan WT-αS we ΔCt-αS görnüşlerinde dürli belok sebitleriniň shematiki görnüşi.Amfipatiki N terminaly domeni, gidrofob amiloid emele getirýän (NAC) sebiti we negatiw zarýadly C terminaly domeni degişlilikde gök, mämişi we gyzyl reňklerde görkezilýär.WT-αS galyndysyna arassa zarýad (NCPR) kartasy görkezilýär.b Makromolekulýar bölekleriň ýoklugynda αS / pLK täsiriniň NMR derňewi.PLK konsentrasiýasynyň artmagy bilen (αS: 1: 0,5, 1: 1.5 we 1:10 pLK molar gatnaşygy degişlilikde açyk ýaşyl, ýaşyl we goýy ýaşyl reňklerde görkezilýär).c LLPS buferinde (ýokarsynda) ýa-da 500 mM NaCl (aşaky çepde) ýa-da 10-dan soň 25 µM (1 µM AF488 belgili αS ýa-da WF şekillendiriş üçin Atto647N belgili pLK) Coacervate αS / pLK (molar gatnaşygy 1:10) % 1,6-heksanediol (1,6-HD; aşaky sagda).Tereziniň çyzgysy = 20 µm.d 25 μM konsentrasiýasynda αS / pLK (molar gatnaşygy 1:10) BF damjasynyň birleşmeginiň wekili mikroskopiki şekilleri;oklar aýry-aýry damjalaryň (gyzyl we sary oklar) täze damja (mämişi ok) 200 ms içinde birleşmegini görkezýär.Tereziniň çyzgysy = 20 µm.e LLPS buferinde ýeňil ýaýramak (350 nm) αS / pLK agregasiýasy 500 mM NaCl ýa-da 25 µM αS-de 10% 1,6-HD goşulandan soň (N = 3 nusga köpelýär, ortaça we adaty gyşarma hem görkezilýär).f BF şekili (ýokarda) we lightS / pLK agregasiýasynyň 25 μM αS derejesinde ýeňil ýaýramagyň derňewi (350 nm, aşaky) αS: pLK molar gatnaşygy (N = 3 nusga köpelýär, ortaça we adaty gyşarma hem görkezilýär).Tereziniň çyzgysy = 10 µm.Bir suratdaky masştab çyzgysy, bir paneldäki ähli şekilleriň masştabyny görkezýär.Çig maglumatlar çig maglumatlar faýllary görnüşinde berilýär.
SS / pLK elektrostatiki çylşyrymly kondensasiýa we tau31 bilen göni täsirleşmek arkaly tau / RNA kondensatynyň müşderi molekulasy hökmünde αS-iň öňki synlamalaryna esaslanyp, αS we tau RNK ýok mahaly çözüji bilen aýrylyp biljekdigini çakladyk. kondensasiýa.elektrostatik toplumlaryň üsti bilen, αS αS / Tau koakerwatlardaky skafly belokdyr (2e suratda tau zarýadynyň paýlanyşyna serediň).LLPS buferinde 10 μM αS we 10 μM Tau441 (degişlilikde 1 μM AF488-αS we 1 μM Atto647N-Tau) birleşdirilende, WF mikroskopiýasyndan görnüşi ýaly, iki belogy öz içine alýan belok agregatlaryny aňsatlyk bilen emele getirendik.(2a surat).Iki damjanyň damjalardaky kolokalizasiýasy konokok (CF) mikroskopiýasy bilen tassyklandy (Goşmaça 1a surat).Şuňa meňzeş hereket, dekstran-70 jemleýji serişde hökmünde ulanylanda ýüze çykdy (Goşmaça 1c surat).FITC belgili PEG ýa-da dekstran ulanyp, ýygnanýan iki agentiň hem bölünişigi ýa-da birleşmäni görkezmeýän nusgalaryň arasynda deň paýlanandygyny gördük (Goşmaça 1d surat).Has dogrusy, bu ulgamda beýleki LLP ulgamlarynda görkezilişi ýaly PEG ileri tutulýan durnukly köp adam serişdesi bolany üçin, makromolekulýar ýygnanma effektleri arkaly fazanyň bölünmegini öňe sürýär.Beloklara baý bu damjalar NaCl (1 M) duýgur, ýöne elektrostatiki aýratynlyklaryny tassyklaýan 1,6-HD (10% v / v) duýgur däldi (Goşmaça 2a surat, b).Olaryň suwuk hereketleri BF mikroskopiýasy arkaly millisekuntda damjalaryň birleşmegini synlamak bilen tassyklandy (2-nji surat).
LLPS buferinde αS / Tau441 koakerwatlarynyň Confocal (CF) mikroskopiýa şekilleri (her belokdan 10 μM, AF488 belgili αS we Atto647N belgili Tau441).b αS / Tau441 damjasynyň birleşmegi hadysalarynyň (her belok üçin 10 μM) wekilçilikli diferensial päsgelçilik kontrasty (DIC) şekilleri.c Tau441 LLPS (0–15 µM) ýagtylygyň ýaýramagy (350 nm) 50 µM αS ýok wagtynda (çepde) ýa-da ýokda (sagda) faza diagrammasy.Armyly reňkler has köp ýaýramagy görkezýär.d αS konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy bilen αS / Tau441 LLPS nusgalarynyň ýeňil ýaýramagy (Tau441 5 µM, N = 2–3 nusga gaýtalanmalary).e Bu gözlegde ulanylýan käbir tau belok görnüşleriniň we belogyň dürli sebitleriniň shematiki görnüşi: negatiw zarýadly N-terminal domeni (gyzyl), proline baý sebit (gök), mikrotubula baglaýjy domen (MTBD, mämişi reňkde görkezilen) we amiloid emele getirýän jübüt spiral.MTBD (çal) içinde ýerleşýän filament sebitleri (PHF).Tau441-iň galyndysyna arassa zarýad (NCPR) kartasy görkezilýär.f 1NM-AF488 belgili αS we Atto647N belgili ΔNt- ulanmak, ΔNt-Tau (ýokarky belok üçin 10 µM) ýa-da K18 (aşaky, 50 µM) 1 µM AF488 belgili αS ýa-da ΔCt-αS ulanmak. ))) LLPS ýa-da K18 buferinde kondensirlenen WF-iň mikrograflary.Bir suratdaky şkalalar, bir paneldäki ähli şekilleriň masştabyny görkezýär (a, b we f paneller üçin 20 µm).C we d paneller üçin çig maglumatlar çig maglumatlar faýly hökmünde berilýär.
Bu LLPS prosesinde αS-iň roluny barlamak üçin, ilki bilen NaCl-iň artýan konsentrasiýalaryny ulanyp, nefelometriýa arkaly αS-iň damjanyň durnuklylygyna täsirini derňedik (2-nji surat).SS bolan nusgalarda duz konsentrasiýasy näçe ýokary bolsa, bu LLPS ulgamynda αS-iň durnuklaşdyryjy roluny görkezýän ýagtylygyň ýaýramagy (350 nm) şonça ýokarydyr.Şuňa meňzeş täsiri αS konsentrasiýasyny (we şonuň üçin αS: Tau441 gatnaşygy) takmynan ýokarlandyrmak arkaly synlamak bolýar.Tau konsentrasiýasyna (5 µM) garanyňda 10 esse ýokarlanmak (2-nji surat).SS-iň koakerwatlardaky bir belokdygyny görkezmek üçin, otNt-Tau diýlip atlandyrylýan negatiw zarýadly N terminaly sebiti bolmadyk (1-150 galyndy, 2e surata serediň) LLPS bozulan Tau mutantynyň özüni alyp barşyny öwrenmek kararyna geldik.WF mikroskopiýasy we nefelometri, öň habar berlişi ýaly ΔNt-Tau-nyň LLPS (2-nji surat we goşmaça 2d surat) geçmändigini tassyklady, ýöne bu kesilen Tau görnüşiniň dispersiýa çözgütlerine αS goşulanda, LLPS prosesi doly boldy. şuňa meňzeş şertlerde we belok konsentrasiýalarynda Tau we αS doly ölçegli erginleriniň damja dykyzlygyna ýakyn damja dykyzlygy bilen dikeldildi.Bu prosesi pes makromolekulýar ýygnanan şertlerde hem synlamak bolýar (Goşmaça 2c surat).LLPS prosesinde C terminaly αS sebitiniň roly, ýöne tutuş uzynlygy däl, (ΔCt-) 104–140 galyndylary bolmadyk C terminaly kesilen αS görnüşini ulanyp, damjanyň emele gelmeginiň gadagan edilmegi görkezildi. αS) belok (2f surat we goşmaça surat 2d).SS we tNt-Tau-nyň kolokalizasiýasy konokok floresan mikroskopiýasy bilen tassyklandy (Goşmaça 1b surat).
Tau441 bilen αS arasynda LLPS mehanizmini has-da barlamak üçin goşmaça Tau warianty ulanyldy, ýagny mikrotubula baglaýjy domeniň (MTBD) jübütlenen heliki filament ýadrosy (PHF) bölegi, eger-de dört häsiýetli gaýtalanýan domen bar bolsa, adatça belli. K18 bölegi hökmünde (2e surata serediň).Recentlyaňy-ýakynda αS-iň mikrotubula baglaýan domeniň öňünden yzygiderlilikde proline baý domende ýerleşýän tau belogy bilen ileri tutulýandygy habar berildi.Şeýle-de bolsa, PHF sebiti pololyitel zarýadly galyndylara baý (2e surata serediň), esasanam lizine (15% galyndy), bu sebitiň αS / Tau toplumynyň kondensasiýasyna goşant goşýandygyny ýa-da ýokdugyny barlamaga mejbur etdi.Synag şertlerinde (15% PEG ýa-da 20% dekstranly LLPS buferi) diňe K18-iň 100 MM çenli konsentrasiýalarda LLPS döredip bilmejekdigini gördük (2-nji surat).Şeýle-de bolsa, 50 µM K18-e 50 µM αS goşanymyzda, nefelometriýa (Goşmaça 2d surat) we WF mikroskopiýasy (2-nji surat) K18 we αS bolan belok damjalarynyň çalt emele gelmegine syn edildi.Garaşylyşy ýaly, ΔCt-αS K18-iň LLPS hereketini dikeldip bilmedi (2-nji surat).SS / ΔNt-Tau ýa-da αS / Tau441 bilen deňeşdirilende, LLPS-e itergi bermek üçin αS / K18 jemlenişiniň birneme ýokary belok konsentrasiýasyny talap edýändigini belläris.Bu, αS C terminaly sebitiniň proline baý Tau domeni bilen, 31-nji bölümde görkezilişi ýaly, mikrotubula baglaýjy domen bilen deňeşdirilende has güýçli täsiri bilen gabat gelýär.
TNt-Tau αS ýok mahaly LLPS ýerine ýetirip bilmeýändigini göz öňünde tutup, bu uzynlykly Tau (izotip, Tau441 / Tau441) LLPS ulgamlarynda ýönekeýligini göz öňünde tutup, αS / Tau LLPS häsiýetlendirmek üçin bu Tau görnüşini saýladyk.çylşyrymly (heterotip, αS / Tau441) jemleýiş amallary bilen.CentS / Tau we αS / ΔNt-Tau ulgamlarynda αS agregasiýa derejesini (kondensirlenen faza belogynyň bir bölegi hökmünde fαS, c) deňeşdirdik we SDS-PAGE derňewi (2e seret) bilen deňeşdirdik. Ähli konsentrasiýadaky ähli beloklar üçin.Hususan-da, αS / Tau we αS / ΔNt-Tau üçin fαS, c 84 ± 2% we 79 ± 7% aldyk, bu αS bilen tau arasyndaky heterotipiki täsiriň tau molekulalarynyň özara täsirinden has ýokarydygyny görkezýäris.arasynda.
Dürli polikasiýa bilen özara täsir we kondensasiýa prosesiniň αS kinetikasyna täsiri ilkinji gezek fotobleaching (FRAP) usulyndan soň floresan dikelişi bilen öwrenildi.SS / Tau441, αS / ΔNt-Tau we αS / pLK koakerwatlaryny (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS we 100 μM Tau441 ýa-da ΔNt-Tau ýa-da 1 mM pLK) synagdan geçirdik.Nusga komponentlerini garyşdyrandan soň ilkinji 30 minudyň içinde maglumatlar alyndy.Wekilçilikli FRAP şekillerinden (3a surat, αS / Tau441 kondensasiýa) we degişli wagt kurslarynyň egrilerinden (3-nji surat, goşmaça 3-nji surat), αS kinetikasynyň Tau441 koakerwatlaryna gaty meňzeýändigini görmek bolýar.we pNK-Tau, pLK bilen has çalt.FRAP boýunça koakerwatyň içindäki αS üçin hasaplanan diffuziýa koeffisiýentleri (Kang we başg. 35-de beýan edilişi ýaly) D = 0.013 ± 0,009 µm2 / s we αS / Tau441 we αS / ΔNt- üçin D = 0.013 ± 0.008 µm2 / s. αS / ulgamy.pLK, Tau we D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s (3-nji surat).Şeýle-de bolsa, dargadylan fazadaky αS diffuziýa koeffisiýenti, şol bir şertlerde (LLPS buferi), ýöne polikasiýa bolmadyk ýagdaýynda, Floresan korrelýasiýa spektroskopiýasy (FCS, goşmaça 3-nji surata serediň) tarapyndan kesgitlenen ähli kondensirlenen fazalardan has ýokary ululykdaky sargytlardyr. (D = 8 ± 4 µm2 / s).Şonuň üçin αS terjimesiniň kinetikasy, aýdylýan molekulýar mähelläniň täsiri sebäpli dargadylan fazadaky beloklar bilen deňeşdirilende ep-esli azalýar, ýöne ähli koakerwatlar tau fazasyndan tapawutlylykda emele geleninden soň ilkinji ýarym sagadyň dowamynda suwuklyga meňzeş häsiýetleri saklaýar.pLK kondensatynda has çalt kinetika.
elektrostatik koakerwatlarda αS dinamikasynyň (2% AF488 belgili αS) FRAP derňewi.Üçlükdäki αS / Tau441 FRAP analizleriniň şekil şekilleri (a) -da görkezilýär, bu ýerde gyzyl tegelekler reňklenen ýerleri görkezýär.Tereziniň çyzgysy 5 µm.b Ortaça FRAP egrileri we (c) 100 µM αS we Tau441 (gyzyl) ýa-da tNt-Tau (gök) ýa-da pLK (ýaşyl) ekimolýar konsentrasiýalaryny ulanyp, üç synagdan 5–6 (N) dürli damjalar üçin hasaplanan diffuziýa koeffisiýentleri (D) LLPS konsentrasiýasynyň on essesinde.FRAP egrisiniň adaty gyşarmasy kölegeli reňkde görkezilýär.Deňeşdirmek üçin, dargadylan fazadaky αS diffuziýa koeffisiýenti floresan korrelýasiýa spektroskopiýasy (FCS) ulanyp üçlükde kesgitlenildi (Goşmaça 3-nji surata we has giňişleýin maglumat üçin usullara serediň).d LLPS buferinde hiç hili polikasiýa (gara) ýa-da 100 μM Tau441 (gyzyl) ýa-da tNt-Tau (gök) ýa-da 1 mM pLK (ýaşyl) bolan 100 μM TEMPOL-122-αS üznüksiz X-band EPR spektri.Goşgy, iň düýpli üýtgeşmeleriň bolup geçýän güýçli meýdan çyzyklarynyň ulaldylan görnüşini görkezýär.e LLPS ýok bolsa (PEG ýok) dürli polikasiýa bilen 50 μM TEMPOL-122-αS egriji egriler.Adatylaşdyrylan EPR spektriniň II zolagy (IIII / III) bilen deňeşdirilende III zolagyň amplitudasynyň peselmegi Tau441 (gyzyl), ΔNt-Tau (gök) we pLK (ýaşyl) nisbatlaryny ýokarlandyrýar.Reňkli çyzyklar, her egride n birmeňzeş we garaşsyz baglanyşyk ýerleri bolan gödek baglanyşyk modelini ulanyp, maglumatlara laýykdygyny görkezýär.Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.
Goşmaça hökmünde, dürli aýlawly bellikleri (SDSL) we üznüksiz elektron paramagnetiki rezonansyny (CW-EPR) ulanyp, dürli koakerwatlarda αS dinamikasyny derňedik.Bu usul, hakyky galyndy çözgüdi36,37,38 bilen göçüp gelenleriň çeýeligini we dinamikasyny habar bermekde örän peýdalydygyny subut etdi.Bu maksat bilen, bir Cys mutantynda sistein galyndylaryny gurduk we 4-gidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) aýlaw zondyny ulandyk.Maleimid emele gelenleri bellik edýär.Has takygy, 122 ýa-da 24 αS (TEMPOL-122-αS we TEMPOL-24-αS) ýagdaýynda TEMPOL zondlaryny goýduk.Birinji ýagdaýda, polikasiýa bilen täsirleşýän belokyň C terminaly sebitini nyşana alýarys.Munuň ýerine 24-nji pozisiýa kondensatda beloklaryň umumy dinamikasy barada maglumat berip biler.Iki ýagdaýda-da dargadylan fazanyň beloklary üçin alnan EPR signallary çalt hereket edýän ýagdaýynda nitroksid radikallaryna gabat gelýär.Tau ýa-da pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ýa-da tNt-Tau 1: 1 nisbatynda ýa-da pLK 1:10 nisbatynda) fazanyň bölünişiginden soň, iň ýokary intensiwligiň ýokarlanmagy hasaba alyndy αS EPR spektri.Lossitgi çyzygy, damjalarda αS reorientasiýa kinetikasynyň suwuk fazadaky belok bilen deňeşdirilende azalandygyny görkezýär (3-nji surat, goşmaça 4a surat).Bu üýtgeşmeler 122-nji pozisiýada has aýdyň görünýär. 24-nji pozisiýada pLK-nyň bolmagy zondyň kinetikasyna täsir etmedi, 122-nji ýerde spektral çyzygyň görnüşi ep-esli üýtgedi (Goşmaça 4a surat).Spektrleri iki sany αS / polikasiýa ulgamynyň 122-nji ýerinde modellemäge synanyşanymyzda, IDP38,39 aýlawly belgili dinamikany beýan etmek üçin ulanylýan izotrop modelini (Goşmaça 5a surat) ulanyp, synag spektrini täzeden gurup bilmedik..24 aýlawyň ýagdaýynyň spektral simulýasiýasy (Goşmaça 5a surat).Bu, C terminaly sebitiniň aýlaw konfigurasiýalarynyň giňişliginde polikasiýa bar bolan ýagdaýynda artykmaç pozisiýalaryň bardygyny görkezýär.Synag EPR şertlerinde kondensirlenen fazadaky αS böleklerine seredilende (degişlilikde αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau we αS / pLK üçin 84 ± 2%, 79 ± 7% we 47 ± 4%) Goşmaça serediň. Maglumatlaryň derňewiniň 2e suraty c), EPR usuly bilen ýüze çykarylan giňelişiň, esasan, αS C terminaly sebtiniň kondensirlenen fazada dürli polikasiýa bilen täsirini görkezýändigini görmek bolýar (TEMPOL-122- proteinS), we belok kondensasiýasy däl.Zondda mikrowiskozitiň ýokarlanmagy ýüze çykýar.Garaşylyşy ýaly, garyndynyň içine 1 M NaCl goşulanda LLPS-den başga şertlerde belogyň EPR spektri doly dikeldildi (Goşmaça 4b surat).Umuman aýdanymyzda, maglumatlarymyz CW-EPR tarapyndan ýüze çykarylan üýtgeşmeleriň, esasan, αS C terminaly sebitiniň kondensirlenen fazada dürli polikasiýalar bilen täsirini görkezýändigini we bu täsiriň Tau bilen deňeşdirilende pLK bilen has güýçli bolandygyny görkezýär.
Koakerwatda beloklar barada has köp gurluşly maglumat almak üçin LLPS ulgamyny erginde NMR ulanyp öwrenmegi makul bildik.Şeýle-de bolsa, diňe dargadylan fazada galan αS fraksiýasyny kesgitläp bilýärdik, bu koakerwatyň içindäki belok dinamikasynyň peselmegi we NMR derňewinde çözgüdiň aşagyndaky dykyz faza sebäpli bolup biler.NMR (Goşmaça 5c, d) ulanyp, LLPS nusgasynyň dargadylan fazasynda galan belogyň gurluşyny we dinamikasyny seljerenimizde, belokyň ikisiniň hem pLK we ΔNt-Tau barlygynda birmeňzeş hereket edendigini gördük. Ikinji derejeli himiki üýtgeşiklik we R1ρ dynç alyş boýunça geçirilen synaglar arkaly ýüze çykarylan belok oňurgasynyň dinamikasynda.NMR maglumatlary, αS C terminalynyň polikasiýa bilen täsiri sebäpli, belok yzygiderliliginiň beýleki bölekleri ýaly tertipsiz tebigatyny saklap, sazlaşykly çeýeligiň ep-esli ýitgisini görkezýär.
TEMPOL-122-αS kondensirlenen fazada syn edilen CW-EPR signalynyň giňelmegi, belogyň polikasiýa bilen özara täsirini görkezýändigi sebäpli, LLPS ýok mahaly αS-iň dürli polikasiýalara baglanyşygyny kesgitlemek üçin EPR titrini etdik. Bufer LLPS), özara täsirleriň suwuk we konsentrirlenen fazalarda birmeňzeşdigini öňe sürýär (bu biziň maglumatlarymyz bilen tassyklanýar, goşmaça 4a surat we goşmaça 6-njy surat).Maksat, umumy suwuklyga meňzeş häsiýetlerine garamazdan, ähli koakerwatlaryň molekulýar derejesinde haýsydyr bir diferensial häsiýeti görkezýändigini ýa-da ýokdugyny görmekdi.Garaşylyşy ýaly, EPR spektri polikasiýa konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy bilen giňeldi, ähli täsirleşýän hyzmatdaşlaryň doýgunlyga çenli molekulýar täsirleri sebäpli molekulýar çeýeligiň peselmegini görkezýär (3e-nji surat, Goşmaça 6-njy surat).pLK bu doýgunlygy ΔNt-Tau we Tau441 bilen deňeşdirilende has pes mukdarda (polikasiýa: αS) gazandy.Aslynda, n birmeňzeş we garaşsyz baglanyşyk ýerlerini göz öňünde tutýan takmynan birleşdiriji model bilen deňeşdirmek, pLK (~ 5 μM) görünýän bölünme üýtgewsizliginiň Tau441 ýa-da ΔNt-Tau (~ 50 μM) derejesinden pes derejededigini görkezdi. ).µM).Bu takmynan çaklama bolsa-da, bu αS-iň üznüksiz polo positiveitel zarýadly sebitler bilen has ýönekeý polikasiýa üçin has ýakynlygynyň bardygyny görkezýär.SS bilen dürli polikasiýalaryň arasyndaky ýakynlygyň bu tapawudyny göz öňünde tutup, olaryň suwuk häsiýetleriniň wagtyň geçmegi bilen üýtgäp biljekdigini we şeýlelik bilen dürli LSPT amallaryndan ejir çekjekdigini çakladyk.
Belok koakerwatynyň içindäki köp adamly gurşawy we belogyň amiloid tebigatyny göz öňünde tutup, LSPT amallaryny ýüze çykarmak üçin wagtyň geçmegi bilen koakerwatyň özüni alyp barşyna syn etdik.BF we CF mikroskopiýasyny ulanyp (4-nji surat) αS / Tau441-iň erginde köp mukdarda birleşip, guýynyň / slaýdyň ýüzüne garaşylýan ýaly doly damjalar ýaly täsir edýän uly damjalary emele getirýändigini gördük (Goşmaça surat 7d);bu aşaky gurluşlara “belok raflary” diýýäris.Bu desgalar birleşdirmek ukybyny saklaýandyklary üçin suwuk bolup galdy (Goşmaça 7b surat) we LLPS işledilenden soň birnäçe sagatlap görmek bolýar (4-nji surat we goşmaça 7c surat).Çyglamak prosesiniň deňagramsyz zarýadly elektrostatik koakerwatlara we şeýlelik bilen ýokary elektrostatik ýer potensialyna garaşylşy ýaly gidrofobik materiallara däl-de, gidrofil materiallara (Goşmaça 7a surat) oňaýlydygyny gördük.Ablyeri gelende aýtsak, αS / ΔNt-Tau birleşmegi we rafting ep-esli azaldy, αS / pLK kondensatlary ep-esli azaldy (4-nji surat).Gysga inkubasiýa döwründe αS / pLK damjalary gidrofiliň üstüni birleşdirip we çyglap ​​bildi, ýöne bu proses çalt togtadyldy we 5 sagat inkubasiýa edilenden soň diňe çäkli birleşme hadysalary we çyglylyk bolmady.- gel damjasynyň geçişi.
100 µM Tau441 (ýokarky) floresan) mikroskopik şekilleriň barlygynda LLPS buferinde 100 µM αS (1% floresan belligi) öz içine alýan koakerwat nusgalarynyň wekili BF (çal reňkli paneller) we CF (sag paneller, AF488 belgili αS). -Tau (ortada) ýa-da 1 mM pLK (aşaky) dürli inkubasiýa wagtlarynda we fokus belentliklerinde (z, tabagyň aşagyndan uzaklyk).Synaglar, birmeňzeş netijeler bilen biri-birine garaşsyz 4-6 gezek gaýtalandy.αS / Tau441 koakerwatlary 24 sagatdan soň çyglanýar we şekilden has uly raf emele getirýär.Imageshli suratlar üçin masştab çyzgysy 20 µm.
Soňra αS / Tau441 LLPS-de emele gelen uly suwuklyga meňzeş belok howuzlarynyň öwrenilen beloklaryň haýsydyr biriniň amiloid birleşmegine sebäp bolup biljekdigini soradyk.AboveS / Tau441 damjalarynyň wagtyň geçmegi bilen ýokardaky ýaly şertlerde WF mikroskopiýasy bilen ýetişdik, ýöne 1 μM AF488 belgili αS we Atto647N belgili Tau441 (5a surat).Garaşylyşy ýaly, kämillik döwründe beloklaryň doly lokalizasiýasyny gördük.Gyzykly tarapy5 sagatdan soň, “nokatlar” diýip atlandyrýan gaýalaryň içinde has güýçli tegelek däl gurluşlar syn edildi, olaryň käbiri αS bilen kolokalizasiýa edildi, käbirleri Tau441-de baýlaşdyryldy (5a surat, ak oklar).Bu tegmiller hemişe αS / ΔNt-Tau üçin αS / ΔNt-Tau üçin gaýalaryň içinde syn edilýär.PLK we Tau ulgamlarynyň damjalarynda birleşmek / çyglamak üçin ukypsyz ýerler ýokdy.SS we Tau441 bolan bu tegmilleriň amiloid ýaly agregatlardygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin, CF mikroskopiýasy bilen şuňa meňzeş synag geçirdik, Tau441-de Atto647N we 12.5 μM amiloid-tioflawin-T (ThT) goşuldy.boýamak.24 sagat inkubasiýa edilenden soňam (5b-nji surat, ýokarky hatar - beloklaryň üstünde galan damjalar) ThS / Tau441 damjalarynyň ýa-da raflaryň ThT-boýagy görülmese-de, gaýalaryň içinde Atto647N-Tau441 bolan ThT-pozitiw gurluşlar gaty gowşakdy.bu, öň beýan edilen tegmilleriň ululygyny, görnüşini we ýerleşişini köpeldýär (5b-nji surat, orta we aşaky hatarlar), tegmilleriň garry suwuklyk koakerwatlarynda emele gelen amiloid ýaly agregatlara laýyk bolup biljekdigini görkezýär.
WF 25 μM αS dürli inkubasiýa wagtlarynda we fokus belentliklerinde (z, çäklendirilmedik düýbünden uzaklyk) 25 μM Tau441 (1 μM AF488 belgili αS we Atto647N belgili Tau441) LLPS buferi bolan mikroskop plastinkasynyň guýusynda) .Alty synag şuňa meňzeş netijeler bilen özbaşdak gaýtalandy.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N belgili Tau441) we 12.5 μM tioflawin-T (ThT) barlygynda 25 μM αS CF mikroskopik şekili.Agramly belok damjalary we goýlan belok süýümleri we tegmiller degişlilikde ýokarky we orta hatarlarda görkezilýär.Aşakdaky hatarda 3 sany garaşsyz göçürmeden gaýalaryň we damjalaryň şekilleri görkezilýär.Ak oklar iki paneldäki ThT-pozitiw nokatlary görkezýär.Imageshli suratlar üçin masştab çyzgysy 20 µm.
Suwukdan gatylyga geçiş döwründe koaservat belok torundaky üýtgeşmeleri has jikme-jik öwrenmek üçin floresan ömri şekillendiriş (FLIM) we Förster rezonans energiýa geçiriş mikroskopiýasy (FRET) ulandyk (6-njy surat we 8-nji we 9-njy goşmaça suratlar).Gatlaklaryň has kondensirlenen ýa-da hatda gaty meňzeş jemlenen belok gurluşyna ýetişmegi, belok bilen oňa birikdirilen floresan zondyň arasynda has ýakyn aragatnaşyga sebäp bolup, gysgaldylan synag möhletinde (τ) öçürmek mümkinçiligini döredip biler diýip çakladyk. , öň beýan edilişi ýaly40., 41, 42Mundan başga-da, goşa bellikli nusgalar üçin (degişlilikde FRET donory we kabul ediji boýag hökmünde AF488 we Atto647N), τ bu peselme, kokserwat kondensasiýasy we LSPT döwründe FRET (E) netijeliliginiň ýokarlanmagy bilen hem bolup biler.Wagtyň geçmegi bilen LLPS αS / Tau441 we αS / ΔNt-Tau nusgalarynda (αS belgili 1 µM AF488 we Tau441 ýa-da ΔNt-Tau belgili Atto647N bolan LLPS buferindäki her belokdan 25 µM) gözegçilik etdik.AF488 (τ488) we Atto647N (τ647N) synaglarynyň floresan ömri, koakerwatlar ýetişensoň birneme azaldy (6-njy surat we goşmaça 8c surat).Gyzykly tarapy, bu üýtgeşiklik, nokatlaryň içinde beloklaryň kondensasiýasynyň ýüze çykandygyny görkezýän (6c-nji surat) nokatlar üçin ep-esli ýokarlandy.Muňa goldaw bermek bilen, 24 sagatda αS / ΔNt-Tau damjalary üçin floresan ömründe düýpli üýtgeşiklik bolmady (8-nji goşmaça surat), damjanyň jelasiýasynyň meneklemekden tapawutly bir prosesdigini we möhüm molekulýar üýtgedip gurmak bilen baglanyşykly däldigini görkezýär; coacervates içinde.Nokatlaryň αS-de dürli ululyklaryň we üýtgeýän mazmunyň bardygyny bellemelidiris, esasanam αS / Tau441 ulgamy üçin (Goşmaça 8e surat).Düwürtik floresan ömrüniň peselmegi, esasanam Tau441 belgili Atto647N (Goşmaça 8a surat) we αS / Tau441 we αS / ΔNt-Tau ulgamlary üçin has ýokary FRET netijeliligi, LLPS-de bäş sagat dowam etmegini görkezýär. işledilenden soň, statiki elektrik içindäki beloklar kondensirlenýär.SS / ΔNt-Tau bilen deňeşdirilende, aşaky we has birmeňzeş FRET bahalary bilen bilelikde αS / Tau441 nokatlarynda aşaky τ647N we birneme ýokary τ488 bahany gördük.Megerem, bu αS / Tau441 ulgamynda, agregatlarda syn edilen we garaşylýan αS bolçulygynyň Tau bilen deňeşdirilende has birmeňzeş, köplenç substoihiometrik bolmagy bilen baglanyşykly bolup biler, sebäbi Tau441-iň özi hem LLPS we agregasiýa bolup biler (Goşmaça 8e surat) .Şeýle-de bolsa, Tau441 we αS ikisi hem bolanda, damjanyň birleşmeginiň derejesi, rafyň emele gelmegi we iň esasysy, suwuk görnüşli koakerwatlaryň içinde beloklaryň toplanmagy iň ýokarydyr.
LLPS buferinde her belokdan 25 μM (1 μM AF488 belgili αS we 1 μM Atto647N belgili Tau441 ýa-da ΔNt-Tau) ömri boýunça floresan mikroskopiýa (FLIM) şekilleri.Sütünlerde dürli ýetişen wagtlarda (30 min, 5 sag we 24 sagat) LLPS nusgalarynyň wekilçilikli şekilleri görkezilýär.Gyzyl çarçuwada αS / Tau441 tegmilleri bolan sebiti görkezýär.Ömrüň dowamlylygy reňk çyzgysy hökmünde görkezilýär.Tereziniň çyzgysy = ähli suratlar üçin 20 µm.b A paneldäki gyzyl gutuda görkezilen saýlanan meýdanyň ulaldylan FLIM şekili.Durmuş aralygy a panelindäki ýaly reňk şkalasy bilen görkezilýär.Tereziniň çyzgysy = 5 µm.c Dürli belok görnüşleri (damjalar-D-, raft-R- we gyrgyç-P) üçin AF488 (αS bilen birikdirilen) ýa-da Atto647N (Tau bilen birikdirilen) gistogrammalar Tau441 we ömri paýlanyş möhleti αS / ΔNt-Tau birleşdiriji nusgalar (D üçin N = 17-32 ROI, R üçin 29-44 ROI, ballar üçin 21-51 ROI).Orta we orta bahalar degişlilikde sary kwadratlar we gutularyň içindäki gara çyzyklar hökmünde görkezilýär.Gutynyň aşaky we ýokarky çäkleri degişlilikde birinji we üçünji kwartallary aňladýar we 1,5 esse ikitaraplaýyn diapazonda (IQR) iň pes we iň ýokary bahalar pyçak hökmünde görkezilýär.Çykyş edenler gara göwher hökmünde görkezilýär.Jübüt paýlamalaryň arasyndaky statistik ähmiýet, deňsizlikleri göz öňünde tutup, iki nusgalyk t-synag arkaly kesgitlenildi.Iki guýrukly t-test p-bahalary deňeşdirilen maglumatlaryň her jübüti üçin ýyldyzjyklar bilen görkezilýär (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value> 0.00001), ns Seresapsyzlygy görkezýär (p-value> 0.05).Takyk p bahalary Goşmaça 1-nji tablisada berilýär we asyl maglumatlar çig mal faýllary hökmünde görkezilýär.
Düwürtikleriň / agregatlaryň amiloid ýaly tebigatyny has-da görkezmek üçin, ýokary konsentrasiýaly (1 M) NaCl bilen 24 sagatlap poslanmadyk koakerwat nusgalaryny bejerdik, bu bolsa agregatlaryň belok koakerwatlaryndan bölünmegine sebäp boldy.Izolirlenen agregatlar (ýagny, agregatlaryň dargadylan ergini) atom güýji mikroskopiýasy (AFM) ulanylanda syn edilende, adaty beýikligi 15 nm bolan esasan sferik morfologiýany synladyk, bu duzuň ýokary konsentrasiýasy şertlerinde birleşmäge ýykgyn edýär. surfaceerdäki güýçli gidrofob täsiri sebäpli adaty amiloid fibrilleriň özüni alyp barşy (fibrilleriň adatça ~ 10 nm beýikligine üns beriň) (Goşmaça 10a surat).Gyzykly tarapy, izolirlenen agregatlar adaty ThT floresan barlagynda ThT bilen inkubasiýa edilende, boýagyň adaty αS amiloid fibrilleri bilen inkubasiýa edilen wagty bilen deňeşdirilende, ThT floresan kwant öndürijiliginiň ep-esli ýokarlanandygyny gördük (goşmaça 10b surat). koakerwat agregatlarynda amiloid ýaly gurluşlar bar..Aslynda, agregatlar duzuň ýokary konsentrasiýasyna çydamlydy, ýöne adaty amiloid fibriller ýaly 4 M guanidin hloridine (GdnHCl) duýgur boldy (Goşmaça 10c surat).
Ondan soň, ýeke molekulanyň floresanlygyny, anyk floresan korrelýasiýa / korrelýasiýa korrelýasiýa spektroskopiýasyny (FCS / FCCS) ulanyp, agregatlaryň düzümini seljerdik we iki reňkli tötänligi ýüze çykarmagyň (TCCD) derňewini etdik.Bu maksat bilen, αS we Tau441 (ikisi hem 25 μM) bolan 100 μl LLPS nusgalarynda 24 sagat inkubasiýa edilenden soň emele gelen agregatlary, 1 μM AF488 belgili αS we 1 μM Atto647N belgili Tau441 bilen izolýasiýa etdik.Alnan dargadylan jemleýji çözgüdi, LLPS bilen belogyň arasynda bolup biläýjek elektrostatiki täsirleriň öňüni almak üçin şol bir PEG erkin bufer we 1 M NaCl (agregatlary kokerwatdan bölmek üçin ulanylýan şol bir bufer) ulanyp, monomolekulýar ýagdaýa siňdiriň.Bir molekulanyň wagt traýektoriýasynyň mysalyny 7a-njy suratda görmek bolýar.FCCS / FCS derňewi (korrelýasiýa, CC we awtokorrelýasiýa, AC) nusgalarda αS we tau bolan agregatlaryň köpdügini görkezdi (7b suratda CC egrisine serediň, çep panel) we galyndy monomer belogynyň artykmaçlygy ýüze çykdy eritme prosesiniň netijesi (7b suratda, çep panelde AC egrilerine serediň).Diňe monomeriki beloklary öz içine alýan nusgalary ulanyp, şol bir çözgüt şertlerinde geçirilen gözegçilik synaglarynda hiç hili CC egrisi görkezilmedi we AC egrileri bir komponentli diffuziýa modeline (Ekr. 4) laýyk gelýär, bu ýerde monomer beloklaryň garaşylýan diffuziýa koeffisientleri bar (7-nji surat). ), sag panel).Jemi bölejikleriň diffuziýa koeffisiýenti 1 µm2 / s-den, monomeriki beloklaryň bolsa 1 µm2 / s töweregi.50–100 µm / s;bahalar, şuňa meňzeş çözgüt şertlerinde sonik αS amiloid fibril we monomer αS üçin öň neşir edilen bahalara meňzeýär44.TCCD partlama derňewi bilen agregatlary seljerenimizde (7-nji surat, ýokarky panel), her izolirlenen agregatda (αS / Tau heteroaggregate) ýüze çykarylan agregatlaryň takmynan 60% -inde αS we tau bar, takmynan 30% -iniň bardygyny gördük. tau, diňe 10% αS.SS / Tau heteroagregatlarynyň stoiometrik derňewi, heteroagregatlaryň köpüsiniň tau bilen baýlaşdyrylandygyny görkezdi (stohiometriýa 0,5-den aşak, her bir tau molekulasynyň ortaça mukdary αS molekulalaryndan 4 esse köp), bu ýerdäki FLIM-de syn eden işimize laýyk gelýär. synaglar..FRET derňewi, bu agregatlaryň ikisinde-de beloklaryň bardygyny görkezdi, ýöne bu ýagdaýda hakyky FRET bahalarynyň ähmiýeti ýok, sebäbi synagda ulanylýan bellikli belogyň köp bolmagy sebäpli her agregatda floroforlaryň paýlanyşy tötänleýin boldy.Gyzykly tarapy, 45,46 ýetişen amiloid agregasiýa ýetmezçilikli Tau wariantyny ulanyp, şol bir derňewi geçirenimizde (Goşmaça 11a, b seret), αS elektrostatik birleşmesiniň birmeňzeşdigine göz ýetirdik (Goşmaça 11c, d), koakerwatyň içinde agregatlary emele getirmek ukyby düýpgöter azaldy we FLIM situ synaglarynda birnäçe nokady tapdy we izolirlenen jemleýji nusgalar üçin gowşak korrelýasiýa egrileri synlandy.Şeýle-de bolsa, az sanly agregatlar üçin (Tau441-iň diňe ondan bir bölegi), her bir agregatyň bu Tau wariantyna garanyňda αS-de baýlaşdyrylandygyny, ýüze çykarylan agregatlaryň takmynan 50% -inde diňe αS molekulalarynyň bardygyny we αS-iň artykmaçdygyny gördük. .agregatlar (Tau441 tarapyndan döredilen birmeňzeş agregatlardan tapawutlylykda 11e goşmaça surata serediň) (6-njy surat).Bu synaglaryň netijesi, αS-iň özi koakerwatyň içinde tau bilen ýygnamaga ukyplydygyna garamazdan, bu şertlerde tau ýadrosynyň has amatlydygyny we amiloid ýaly agregatlaryň αS we tau görnüşinde hereket edip biljekdigini görkezdi.Şeýle-de bolsa, tau baý ýadro emele gelenden soň, taS molekulalarynyň arasyndaky gomotipiki täsirler sebäpli agregatlarda αS we tau arasyndaky heterotipiki täsirler bolýar;suwuk αS / tau coacervates-de belok torlaryny synlaýarys.
αS / Tau441 elektrostatik koakerwatlarynda emele gelen izolirlenen agregatlaryň ýeke molekulalarynyň wagtlaýyn floresan wagtlaýyn yzlary.DetectionS / Tau441 koagregatlaryna laýyk gelýän partlamalar (görkezilen bosagadan ýokary partlamalar) üç sany anyklaýyş kanalynda (göni tolgundyryşdan soň gök we gyzyl çyzyklar, gytaklaýyn tolgunmadan soň Atto647N emissiýasy), FRET, gyrmyzy çyzyk) ýüze çykaryldy.b LLPS-den (çep panel) alnan izolirlenen αS / Tau441 agregatlaryň nusgasynyň FCS / FCCS derňewi.AF488 we Atto647N üçin awtokorrelýasiýa (AC) egrileri degişlilikde gök we gyzyl reňkde, iki boýagy öz içine alýan agregatlar bilen baglanyşykly korrelýasiýa (CC) egrileri gyrmyzy reňkde görkezilýär.AC egrileri bellikli monomer we jemlenen belok görnüşleriniň bardygyny görkezýär, CC egrileri diňe goşa bellikli agregatlaryň ýaýramagyny görkezýär.Şol bir derňew, ýöne izolirlenen nokatlardaky ýaly çözgüt şertlerinde sag panelde diňe monomeriki αS we Tau441 bolan nusgalar görkezilýär.c αS / Tau441 elektrostatik koakerwatlarda emele gelen izolirlenen agregatlaryň ýeke molekulalarynyň floresan fleş derňewi.Dört dürli gaýtalanýan (N = 152) tapylan her jem üçin maglumat, olaryň stoiometriýasyna, S bahalaryna we FRET netijeliligine garşy meýilleşdirilýär (ýokarky panel, reňk çyzgysy hadysany görkezýär).Agregatlaryň üç görnüşini tapawutlandyryp bolar: -S-diňe S ~ 1 we FRET ~ 0 bilen agregatlar, diňe S ~ 0 we FRET ~ 1 bilen Tau agregatlar, we aralyk S we FRET aralygyndaky birmeňzeş Tau / αS agregatlar Her birmeňzeş agregatda (N = 100) ýüze çykarylan marker beloklarynyň ikisi aşaky panelde görkezilýär (reňk şkalasy hadysany görkezýär).Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.
Suwuk belok kondensatlarynyň wagtyň geçmegi bilen jel ýaly ýa-da gaty gurluşlara garramagy, kondensatyň47-iň birnäçe fiziologiki funksiýalaryna, şeýle hem amiloid birleşmesinden öň adaty bolmadyk bir proses hökmünde gatnaşýandygy habar berildi. fazanyň bölünişini we özüni alyp barşyny jikme-jik öwrenýäris.Pes mikromolýar konsentrasiýalarynda we fiziologiki taýdan degişli şertlerde gözegçilik edilýän gurşawda tötänleýin polikasiýa bolan ýagdaýynda LSPT αS (LPS-iň adaty termodinamiki hereketinden soň αS-iň hasaplanan fiziologiki konsentrasiýasynyň> 1 µM50 bolandygyny belläň).Fiziologiki pH-da gaty negatiw zarýadly C terminaly öz içine alýan αS-iň, elektrostatik prosesi arkaly pLK ýa-da Tau ýaly ýokary kationiki bozuk peptidleriň barlygynda LLPS arkaly suwly erginde beloklara baý damjalary emele getirip bilýändigini anykladyk. agregasiýa makromolekulalarynyň barlygynda çylşyrymly kondensasiýa.Bu amal öýjükli gurşawda degişli täsirleri bolup biler, bu ýerde αS hem vitro, hem-de vivo51,52,53,54 kesel bilen baglanyşykly agregasiýasy bilen baglanyşykly dürli polikasiýa molekulalaryna duş gelýär.
Köp gözleglerde, damjalaryň içindäki belok dinamikasy kämillik prosesini kesgitleýän esasy faktorlaryň biri hasaplandy55,56.Elektrostatik αS polikasiýa bilen birleşýär, kämillik prosesi polikasiýa bilen täsirleriň güýjüne, walentine we bu täsirleriň köplügine baglydyr.Deňagramlylyk teoriýasy iki suwuk ýagdaýyň deňagramlylyk landşaftynyň LLPS57,58 hereketlendirýän biopolimerlere baý uly damjanyň bolmagydygyny görkezýär.Damjanyň ösmegine Ostwald kämillik 59, birleşmek60 ýa-da dargadylan fazada erkin monomer sarp etmek arkaly ýetip bolýar61.SS we Tau441, tNt-Tau ýa-da pLK üçin beloklaryň köpüsi bu işde ulanylýan şertlerde kondensatda jemlenendir.Şeýle-de bolsa, doly ölçegli tau damjalary ýerüsti çyglylygyň üstünde çalt birleşse-de, damjanyň birleşmegi we çyglanmagy ΔNt-Tau we pLK üçin bu iki ulgamda suwuk häsiýetleriň çalt ýitmegini görkezýär.FLIM-FRET derňewimize görä, garry pLK we ΔNt-Tau damjalary, asyl damjalar ýaly belok birleşmesiniň derejesini (şuňa meňzeş floresan ömri) görkezdi, bu asyl belok ulgamynyň has berk bolmagyna garamazdan saklanýandygyny görkezýär.
Synag netijelerimizi aşakdaky modelde rasionallaşdyrýarys (8-nji surat).Ilkibaşda wagtlaýyn emele gelen damjalar köplenç elektrostatik öwezini dolmazdan belok torlarydyr we şonuň üçin zarýad deňsizliginiň ýerleri bar, esasanam damja interfeýsinde, ýokary elektrostatik ýer potensialyna eýe bolan damjalar.Zarýadyň öwezini dolmak (köplenç walentiň tükenmegi diýlip atlandyrylýan hadysa) we damjalaryň üstki potensialyny azaltmak üçin damjalar suwuk fazadan täze polipeptidleri öz içine alyp biler, zarýad-zarýad täsirini optimallaşdyrmak we beýleki damjalar bilen täsirleşmek üçin belok torlaryny üýtgedip biler.ýüzleri bilen (çygly).ProteinS / pLK damjalary, has ýönekeý belok ulgamy (diňe αS we pLK arasyndaky heterotipiki täsirler) we belok-belok täsiri üçin has ýakynlygy sebäpli, kondensatyň zarýadyny has çalt deňleşdirip bilýän ýaly;hakykatdanam, ilki döredilen αS / pLK koakerwatlarynda proteinS / Tau-dan has çalt belok kinetikasyna syn etdik.Walentiň tükenmeginden soň özara täsirler az efemer bolýar we damjalar suwuklyk häsiýetlerini ýitirýärler we pes elektrostatik ýerüsti potensialy bolan jele meňzeş, ýanmaýan damjalara öwrülýärler (we şonuň üçin üstüni çyglandyryp bilmeýärler).Munuň tersine, has çylşyrymly belok torlary (gomotip we heterotip täsiri bilen) we beloklaryň özara täsiriniň gowşaklygy sebäpli αS / Tau damjalary damja zarýadynyň balansyny optimizirlemekde has täsirli.Bu, uzak wagtyň dowamynda suwuk häsiýeti saklaýan we birleşmek we ulalmak bilen peselip bilýän ýokary elektrostatik ýerüsti potensialyny görkezýän damjalaryň döremegine sebäp bolýar (şeýlelik bilen damjalaryň üstki meýdanyny / göwrümini azaldyp) we gidrofil ýerüsti himiýany nemlendirýär.Bu, belok torundaky zarýad optimizasiýasynyň yzygiderli gözlegi sebäpli özara täsirler gaty wagtlaýyn bolany üçin suwuklyk häsiýetlerini saklaýan uly konsentrirlenen belok kitaphanalaryny döredýär.Gyzykly tarapy, Tau-nyň N-terminaly kesilen görnüşleri, şol sanda käbir tebigy ýüze çykýan izoformlar 62-de aralyk häsiýeti görkezýär, käbir koakerwatorlar αS bilen uzak ömürli jel damjalaryna, beýlekileri bolsa uly suwuk kondensatlara öwrülýär.SS elektrostatik koakerwatlaryň ýetişmeginde bu ikitaraplaýynlyk, kondensatyň ululygyny we suwuklyk häsiýetlerini dolandyrmagyň açary hökmünde walentiň azalmagy bilen kondensatlardaky elektrostatik elekleriň arasyndaky baglanyşygy kesgitlän LLPS teoretiki we tejribe işlerine laýyk gelýär.Mehanizm 58.61.
Bu shema LLPS we LSPT arkaly αS we Tau441 üçin amatly amiloid jemleniş ýoluny görkezýär.Goşmaça anion baý (gyzyl) we kationlara baý (gök) sebitler bilen, kanagatlanarly walentli αS we tau elektrostatik koakerwatlar ýerüsti energiýany peseldýär we şonuň üçin az birleşýär, bu bolsa damjanyň çalt garramagyna sebäp bolýar.Durnukly aglomeratiw gel ýagdaýy gazanylýar..Bu ýagdaý, has ýakynlygy we jele meňzeş çalt geçmäge mümkinçilik berýän has ýönekeý belok jübüt täsiri ulgamy sebäpli αS / pLK ulgamy üçin örän amatlydyr.Munuň tersine, kanagatlanarly walentli damjalar we şonuň üçin özara täsir etmek üçin belokly zarýadly sebitler, ýokary ýerüsti energiýasyny azaltmak üçin kooferwatyň gidrofil ýerini birleşdirmegini we çyglamagyny aňsatlaşdyrýar.Bu ýagdaý, gowşak Tau-Tau we αS-Tau täsirlerinden ybarat köpugurly çylşyrymly tora eýe bolan αS / Tau441 koakerwatlary üçin has amatlydyr.Öz gezeginde has uly koakerwatlar, suwuklyga meňzeş häsiýetleri has aňsat saklar we beýleki belok-belok täsirleşmegine ýol açar.Netijede, neýrojeneratiw keselleriň alamatlary bolan goşma organlarda tapylanlar bilen baglanyşykly bolup bilýän, koaservat suwuklygynyň içinde αS we tau görnüşini öz içine alýan amiloid heterogen agregatlar.
Düwürtikli, ýöne dinamiki belok gurşawy bilen αS / Tau441 ýetişen mahaly emele gelen uly suwuklyga meňzeş gurluşlar we az derejede αS / ΔNt-Tau koakerwatlary beloklaryň jemlenmegi üçin ideal suw howdanlarydyr.Hakykatdanam αS we tau saklaýan belok koakerwatlarynyň bu görnüşinde gaty belok agregatlarynyň emele gelşine syn etdik.Bu heteroagregatlaryň elektrostatik däl täsirler bilen durnuklaşýandygyny, amiloid aýratyn ThT boýaglaryny adaty amiloid fibrilleri bilen birleşdirip biljekdigini we hakykatdanam dürli täsirlere meňzeş garşylygynyň bardygyny görkezdik.LLPS tarapyndan emele gelen αS / tau agregatlarynyň amiloid ýaly häsiýetleri görkezildi.Hakykatdanam, amiloid agregasiýasynda Tau ýetmezçiliginiň ýetişen görnüşi, suwuk elektrostatik koakerwatyň içinde bu birmeňzeş αS agregatlaryň emele gelmeginde ep-esli bozulýar.SS / Tau441 agregatlarynyň emele gelmegi diňe suwuklyga meňzeş häsiýetleri saklaýan we koakerwatlar / damjalar jel ýagdaýyna ýetmedik ýagdaýynda hiç wagt syn edilmedi.Ikinji ýagdaýda, elektrostatik täsirleriň güýçlenmegi we netijede belok ulgamynyň berkligi, amiloid ýadrosy üçin zerur bolan täze belok täsirini döretmek üçin beloklaryň zerur sazlaşykly tertipleşdirilmeginiň öňüni alýar.Muňa garamazdan, has çeýe, suwuk görnüşli koakerwatlarda gazanyp bolar, ululygy ulaldygyça suwuk bolup galmagy ähtimal.
Kondensirlenen fazanyň içinde agregatlaryň emele gelmegi, çalt gelýän kiçijik damjalara garanyňda uly αS / Tau kondensatlarynda has ileri tutulmagy, damjanyň birleşmegine gözegçilik edýän faktorlary kesgitlemegiň möhümdigini görkezýär.Şeýlelik bilen, diňe fazany bölmek meýli bolman, eýsem kadanyň işlemegi we keseliň öňüni almak üçin kondensatyň ululygy gözegçilikde saklanmalydyr 58,61.Netijelerimiz, LLPS we LSPT arasyndaky deňagramlylygyň αS / Tau ulgamy üçin ähmiýetini hem görkezýär.Damjanyň emele gelmegi, beýleki ulgamlarda teklip edilişi ýaly, doýma şertlerinde bar bolan belok monomerleriniň mukdaryny azaltmak arkaly amiloid agregasiýasyndan gorap bilýän bolsa-da, ýokary damja derejesinde damjanyň birleşmegi haýal sazlaşykly üýtgeşmeler arkaly içerki beloklaryň birleşmegine sebäp bolup biler.belok ulgamlary..
Umuman aýdanymyzda, maglumatlarymyz LSPT kontekstinde birleşýän walentiň we düşýän torlarda kanagatlanarly / kanagatlanmadyk täsirleriň ähmiýetini nygtaýar.Hususan-da, doly uzynlykdaky αS / Tau441 kondensatlarynyň beloklary öz içine alýan we synag synaglarymyzyň netijelerine esaslanýan molekulýar mehanizmi teklip edýän amiloid ýaly heteroagregatlary emele getirip, birleşdirip we ýadro edip biljekdigini görkezýäris.Bu ýerde habar berýän αS / Tau suwuk koakerwatda iki sany belokyň birleşmegi hakykatdanam keseliň alamatlary bolan iki belokyň birleşmegi bilen baglanyşykly bolup biler we LLPS bilen gatnaşyklaryň düşünilmegine goşant goşup biler. amiloid birleşmesi, newrodegenerasiýada ýokary zarýadly IDP üçin ýol açýar.
Monomeriki WT-αS, sistein mutantlary (Q24C-αS, N122C-αS) we ΔCt-αS görnüşleri (Δ101-140) E. colide aňladyldy we öň beýan edilişi ýaly arassalandy.5 mM DTT disulfid baglanyşygynyň döremeginiň öňüni almak üçin αS sistein mutantlaryny arassalamak üçin ähli ädimlere girizildi.Tau441 izoform (Addgene # 16316-dan alnan plazma), ΔNt-Tau warianty (Δ1–150, CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) primer) E. coli medeniýetleri bardy 37 ° C we 180 aýlawda OD600 = 0.6–0.7 ulaldy we aňlatma IPTG bilen 37 ° C-de 3 sagatlap görkezildi.11,500 xg öýjükleri 4 ° C-de 15 minutda ýygnaň we 150 mM NaCl bolan duzly bufer bilen ýuwuň.Pelletini liz buferinde saklaň (1 L LB üçin 20 ml: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, kopeptin 100 μM).Sonikasiýa basgançagy 10 impuls üçin 80% amplituda bilen buzda geçirildi (1 minut, 1 minut dynç).Bir ultrases barlagynda 60 ml-den geçmäň.E. coli lizatlar 95 ° C-de 20 minut gyzdyryldy, soňra buzda sowadyldy we 127,000 × g 40 minutda merkezden gaçyryldy.Arassalanan adatdan daşary tebigat 3,5 kDa membranada (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, Angliýa) ulanyldy we 4 L dializ buferine (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) ulanyldy. , PMSF 0,1 mM) 10 sagatlap.5 ml kation alyş-çalyş sütüni (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ABŞ) deňagramlylyk buferi bilen deňleşdirildi (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Tau lizat 0,22 μm PVDF süzgüji arkaly süzüldi we 1 ml / min akym tizliginde sütüne sanjym edildi.Elitasiýa ýuwaş-ýuwaşdan geçirildi, tau 15-30% elitasiýa buferi (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 m PMSF) bilen uzaldyldy.Bölekler SDS-PAGE tarapyndan derňeldi we tau garaşylýan molekulýar agramy bolan bir zolagy öz içine alýan islendik bölekler 10 kDa sentrifuga süzgüji bilen jemlenip, 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM we DTT 2 mM bolan bufer bilen çalşyryldy iň soňky belok konsentrasiýasy 100 μM boldy.Belok ergini 0,22 μm PVDF süzgüçden geçdi, çalt doňdy we -80 ° C derejesinde saklandy.Belok K18, professor Alberto Boffi tarapyndan mähirli üpjün edildi.Taýýarlygyň arassalygy> SDS-PAGE we MALDI-TOF / TOF tarapyndan tassyklanylyşy ýaly 95% boldy.Dürli sisteinlere himiki taýdan AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) ýa-da TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) bilen bellik edildi.siňdiriş we MALDI-TOF / TOF bilen tassyklandy.Tau441, tNt-Tau, AggDef-Tau we K18 şol bir prosedura laýyklykda Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germaniýa) ulanyp, 191 we 322-nji ýerlerde ýerli sistein galyndylary bilen bellik edildi.IdS we Tau441 üçin galyndy kartalaryna arassa zarýad CIDER66 ulanyp döredildi.
Gaty poli-L-lizin (üpjün edijiniň NMR-a görä pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ABŞ) 10 m HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4-10 mM konsentrasiýasynda eritildi, 5-e deňdir ultrases suw wannasynda birnäçe minut we -20 ° C derejesinde saklaň.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biohimpeg, Uatertaun, MA, ABŞ) we FITC-dektran-500 (Sigma -Aldriç, Sant Luis, MI, ABŞ) suwda ereýär we LLPS buferinde giňden ýaýrandyr.Dializ hapalanýan duzlary aýyrýar.Soňra gözenegi ululygy 0,22 mk bolan şpris süzgüji arkaly süzüldi we konsentrasiýalary refraktometr bilen hasaplandy (Mettler Toledo, Kolumbus, Ogaýo, ABŞ).LLPS nusgalary otag temperaturasynda aşakdaky tertipde taýýarlandy: bufer we ekstruziýa garyndy we 1 mM tris (2 karboksietil) fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, Angliýa), 1 mM 2,2,2,2- (Ethane- 1, 2-dildinitril) tetraasetik kislota (EDTA, karboksint) we 1% proteaz ingibitorynyň garyndysy (PMSF 100 mM, benzimid 1 m, leupeptin 5 μM).Soňra αS we birleşdirilen polikasiýa (pLK ýa-da Tau opsiýalary) goşulýar.Tioflawin-T wagt seriýasy synaglary üçin (ThT, Carbosynth, Compton, Angliýa), umumy ThT konsentrasiýasyny αS konsentrasiýasynyň ýarysy hökmünde ulanyň.Birmeňzeşdigini anyklamak üçin nusgalary ýuwaşlyk bilen, ýöne gowy garmaly.Her bir komponentiň konsentrasiýasy, Netijeler bölüminde beýan edilişi ýaly synagdan eksperimente çenli üýtgeýärdi.Azide synagyň dowamlylygy 4 sagatdan geçende 0.02% (w / v) konsentrasiýasynda ulanyldy.LLPS nusgalaryny ulanyp, ähli derňewler üçin garyndynyň derňewden 5 minut öň deňleşmegine rugsat beriň.Lighteňil dargamak derňewi üçin, 150 µl nusga hökmany däl 96 guýy mikroplatlara (leKlear®, gara, F-aşaky / baca guýusy, Greiner bio-one, Kremsmünster, Awstriýa) ýüklendi we ýelimleýji film bilen örtüldi.LLP-ler, CLARIOstar plastinka okaýjysynda (BMG Labtech, Ortenberg, Germaniýa) erginiň merkezinde 350 nm sorulmagy ölçemek arkaly gözegçilik edildi.Synaglar 25 ° C-de üç nusgada geçirildi we ýalňyşlyklar ortaça adaty gyşarma hökmünde hasaplandy.Eritme fazasy merkezden gaçyryş we SDS-PAGE gel derňewi bilen kesgitlenildi we suwuk we konsentrirlenen fazalarda αS fraksiýasy dürli LLPS erginlerinde mukdarda kesgitlenildi.1 μM AF488 belgili αS bolan 100 μl LLPS nusgasy düýpli garyşdyrylyp, 30 minutda 9600 × g sentrifugasiýa bilen taýýarlandy, şondan soň çökgünlik adatça görünýärdi.Adatdan daşary tebigatyň ýokarky 50 μl SDS-PAGE jelini ulanyp, belok mukdaryny kesgitlemek üçin ulanyldy.Jeller, ChemiDoc gel şekillendiriş ulgamyny (Bio-Rad Laboratories, Gerkules, CA, ABŞ) ulanyp, AF488 süzgüçleri bilen skanirlendi ýa-da Coomassie tegmili bilen boýaldy we degişli süzgüçler bilen şekillendirildi.Alnan zolaklar ImageJ wersiýasy 1.53i (Milli saglyk institutlary, ABŞ) ulanylyp seljerildi.Synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen iki dürli synagda iki gezek geçirildi.
Adatça, birleşdirilmedik 96 guýy mikroplatlara 150 μl nusga ulanyldy we Leica DMI6000B ters mikroskopda (Leica Microsystems, Wetzlar, Germaniýa) otag temperaturasynda şekillendirildi.Spoterli synaglar üçin µ-Slaýd Angiogenez plitalary (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniýa) ýa-da 96 guýy polistirol mikroplatlar (Corning Costar Corp., Acton, Massaçusets) ulanyldy.Yşyklandyryş çeşmesi hökmünde EL6000 halogen ýa-da simap metal halid lampalary ulanyldy (degişlilikde BF / DIC we WF şekillendiriş üçin).WF mikroskopiýasy üçin ýagtylygy nusga gönükdirmek we ýygnamak üçin 40x ulaldyjy howa maksady (Leica Microsystems, Germaniýa) ulanyldy.AF488 we ThT bellikli nusgalar üçin, adaty GFP süzgüç toplumlary bilen süzgüç tolgunmasy we zyňyndylary, degişlilikde 460–500 nm we 512–542 nm zolakly süzgüçler we 495 nm ikitaraplaýyn aýna.Atto647N bilen bellik edilen nusgalar üçin degişlilikde 628–40 nm we 692–40 nm tolgundyryjy we zyňyndy zolakly süzgüçli Cy5 süzgüçleri we 660 nm ikitaraplaýyn aýna ulanyldy.BF we DIC mikroskopiýasy üçin şol bir şöhlelendirilen ýagtylygy ýygnamak maksadyny ulanyň.Collectedygnalan ýagtylyk Leica DFC7000 CCD kamerasynda ýazga alyndy (Leica Microsystems, Germaniýa).Ekspozisiýa wagty BF we DIC mikroskopiýa şekillendiriş üçin 50 ms, WF mikroskopiýa şekillendiriş üçin 20-100 ms.Deňeşdirmek üçin, ThT bilen geçirilen ähli synaglaryň täsir ediş wagty 100 ms boldy.Wagtyň geçmegi bilen synaglar, her 100 ms-den birnäçe minutlap ýygnalýan damjalaryň birleşmegini göz öňüne getirmek üçin geçirildi.ImageJ (NIH, ABŞ) şekil derňewi üçin ulanyldy.Synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen üç nusgada geçirildi.
Kolokalizasiýa synaglary, FRAP we 3D rekonstruksiýa üçin ZEN 2 gök neşirini (Karl Zeiss AG, Oberkoçen, Germaniýa) Zeiss LSM 880 tersine konokok mikroskopda suratlar alyndy.50 µl nusgalary µ-Slaýd Angiogenez Petri tagamlaryna (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germaniýa) ulanyldy, gidrofil polimer (ibiTreat) bilen bejerildi we 63 × ýag çümdürmek maksadyna (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) DIC-de).Suratlar 458 nm, 488 nm we 633 nm argon lazer çyzyklary, 0,26 µm / piksel durulykda we 470–600 nm, 493–628 nm, tolgundyryş we zyňyndylary kesgitlemek üçin 8 µs / piksel ekspozisiýa wagty bilen alyndy. we degişlilikde ThT, AF488 we Atto647N şekillendirmek üçin 638–755 nm ulanyldy.FRAP synaglary üçin her nusganyň wagt aralygyndaky suraty sekuntda 1 kadrda ýazga alyndy.Synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen otag temperaturasynda üç nusgada geçirildi.Imageshli suratlar Zen 2 gök neşir programma üpjünçiligi (Karl Zeiss AG, Oberkoçen, Germaniýa) arkaly derňeldi.FRAP egrileri kadalaşdyryldy, meýilleşdirildi we OriginPro 9.1 ulanyp, Zen 2 ulanyp, suratlardan alnan intensiwlik / wagt maglumatlaryna laýyklaşdyryldy.Dikeldiş egrileri, akartma effektini hasaba almak üçin goşmaça ekspensial termin bilen molekulýar diffuziýany hasaba almak üçin mono-ekspensial modele ýerleşdirildi.Soňra nominal akartma radiusyny we Kang we başganyň deňlemesindäki ýaly öň kesgitlenen dikeldiş ýarym ömrüni ulanyp D-ni hasapladyk.5 35 görkezildi.
SS-iň ýekeje sistein wariantlary 24 (TEMPOL-24-αS) we 122 (TEMPOL-122-αS) 4-gidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) bilen sintez edildi. degişlilikdeAýlaw belligi EPR synaglary üçin αS konsentrasiýasy 100 μM, PEG konsentrasiýasy 15% (w / v) boldy.Dürli jemleniş şertleri üçin αS: pLK gatnaşygy 1:10, αS: tNt-Tau we αS: Tau441 gatnaşygy 1: 1-de saklandy.Köp adam bolmadyk ýagdaýynda titrlemek synaglary üçin TEMPOL-122-αS 50 MM-de saklandy we konsentrasiýalaryň köpelmeginde polikasiýalar titrlendi, her şerti aýratyn taýýarlady.CW-EPR ölçegleri, Bruker ELEXSYS E580 X zolakly spektrometr bilen, 9,7 GHz mikrotolkun (SHF) ýygylygynda işleýän Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatory bilen enjamlaşdyryldy.Temperatura 25 ° C derejesinde kesgitlenip, suwuk azot kriostaty bilen dolandyrylýar.Spektr doýmadyk şertlerde 4 MWt kuwwatlylygy, modulýasiýa amplitudasy 0,1 mT we modul ýygylygy 100 kHz.Spektral intensiwlik, Tau441 ýa-da ΔNt-Tau (asyl belok erginlerinde bar) nusgalarynda azaldýan serişdeleriň galyndy konsentrasiýalary sebäpli nusgalaryň arasyndaky aýlaw konsentrasiýalarynyň we pyrlanmagynyň peselmeginiň öňüni almak üçin kadalaşdyryldy.G-iň berlen bahalary, Matlab®67-de ýerine ýetirilen Easyspin programma üpjünçiligini (6.0.0-dev.34) ulanyp ýerine ýetirilen EPR spektral modellemegiň netijesinde alyndy.Maglumatlary modellemek üçin bir / iki komponentli izotrop modeller ulanyldy.Signhli signallary kadalaşdyrandan soň, galyndylar her simulýasiýany degişli synag spektrinden aýyrmak bilen hasaplandy.Baglanyş titriniň derňewi üçin, polikasiýalaryň αS bilen baglanyşygyna gözegçilik etmek üçin üçünji zolagyň kadalaşdyrylan EPR spektriniň (IIII / III) ikinji zolagyna deňeşdirilen intensiwligi ulanyldy.Aýrylyş üýtgewsizligini (Kd) bahalandyrmak üçin, emele gelen egri n birmeňzeş we garaşsyz baglanyşyk ýerlerini göz öňünde tutýan takmynan modele ýerleşdirildi.
NMR spektroskopiýa synaglary, krioprob we Z-gradient bilen enjamlaşdyrylan Bruker Neo 800 MGs (1H) NMR spektrometriniň kömegi bilen geçirildi.Synaglaryň hemmesi 130–207 µM αS we degişli αS / ΔNt-Tau we pLK ekwiwalentleri 10 m HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ulanylyp geçirildi we 15 ° C derejesinde geçirildi.NMR tarapyndan LPS-e gözegçilik etmek üçin öňünden garylan nusgalara 10% PEG goşuldy.Himiki çalşygyň perburbasiýa meýilnamasy (1b surat) ortaça 1H we 15N himiki üýtgemeleri görkezýär.SS 2D1H-15N HSQC spektri öňki tabşyryk (BMRB giriş # 25227) esasynda berildi we HNCA, HNCO we CBCAcoNH 3D spektrini ýazga almak we seljermek arkaly tassyklandy.13Cα we 13Cβ himiki üýtgemeler, arassa tötänleýin rulon konfigurasiýasyndaky αS himiki üýtgemeler bilen deňeşdirilende ikinji derejeli gurluş tendensiýalarynda bolup biljek üýtgeşmeleri ölçemek üçin ΔNt-Tau ýa-da pLK barlygynda hasaplandy (Goşmaça 5c surat).R1ρ nyrhlary hsqctretf3gpsi synaglaryny (Bruker kitaphanasyndan alnan) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 we 800 ms gijikdirmeler bilen ýazga almak bilen ölçenildi we ekspensial funksiýalar dürli derejedäki iň ýokary intensiwlik gijikdirmelerine düzedildi. R1ρ we synag synag näbelliligini kesgitlemek üçin wagtlar.
Iki reňkli wagt çözülen floresan mikroskopiýa synaglary, wagt bilen baglanyşykly ýeke foton sanamak (TCSPC) enjamy bilen söwda wagty çözülen MT200 floresan konokok mikroskopynda (PicoQuant, Berlin, Germaniýa) geçirildi.Lazer diodyň kellesi impulsly interleaved tolgunma (PIE) üçin ulanylýar, şöhle bir re modeim tolkun goragçysyndan geçýär we 481 nm we dioksiki aýnadan soň ölçenen 637 nm lazer çyzyklary üçin 10-dan 100 nW çenli lazer güýji bilen sazlanýar.Bu, fotonyň daşlaşdyrylmagynyň, fotobleachingiň we doýgunlygyň täsirlerinden gaça durup, fotony sanamagyň iň amatly tizligini üpjün edýär.μ-Slaýd angiogeneziniň gapaklary ýa-da plitalary (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniýa) düzediş ýakasy bolan “Super Apochromat 60x NA 1.2” obýektiwiniň üstünde göni suwa çümdürildi (Olympus Life Science, Waltham, ABŞ).Esasy şöhle bölüji hökmünde 488/640 nm ikitaraplaýyn aýna (Semrok, Tokaý köli, IL, ABŞ) ulanyldy.Işlenmedik radiasiýa, diametri 50 mikron bolan deşik bilen ýapylýar, soňra fokusirlenen radiasiýa 50/50 şöhle bölüji bilen 2 kesgitleýiş ýoluna bölünýär.Detektoryň öňünde zolakly zyňyndy süzgüçleri (Semrok, Tokaý köli, IL, ABŞ) 520/35 ýaşyl boýag (AF488) we gyzyl boýag üçin 690/70 (Atto647N) ulanyldy.Detektor hökmünde ýeke fotonly göç diodlary (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italiýa) ulanyldy.Maglumat ýygnamak we derňew, täjirçilik taýdan elýeterli SymphoTime64 programma üpjünçiligi (PicoQuant GmbH, Berlin, Germaniýa) ulanylyp geçirildi.
LLPS nusgalarynyň elli mikroliteri μ-Slaýd angiogenez guýularyna ulanyldy (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germaniýa).Alnan şekiller, togtadylan damjalar üçin iň amatly obýektiw iş aralygy üçin guýynyň düýbünden 20 µm, iň azyndan 0,25 µm / piksel eksenel çözgüdi we gijikdirme wagty 400 µs / piksel üçin ~ 1 µm.Her kanal üçin ortaça fon signalynyň intensiwligine (PBG, ortaça + 2σ) esaslanan intensiwlik çägini ulanyp, dargadylan fazadan gelip çykýan çeşmäni süzüp, diňe suwuk belok damjalary, raf ýa-da tegmiller saýlanar ýaly maglumatlary saýlaň.Her kanalyň (τ) ömrüni (AF488 üçin ýaşyl, “g” we Atto647N üçin “r”) ömrüni seljermek üçin, damjalary, gaýalary ýa-da tegmilleri öz içine alýan gyzyklanma sebitlerini (ROI) saýladyk (Goşmaça 1-nji surat ).8b) we her kanalda guýruga laýyk derňewi we iki komponentli çüýremek modelini ulanyp, ömrüniň çüýremegine (damjalar, gaýalar ýa-da tegmiller üçin τD, τR we τP degişlilikde goşmaça 8-nji surata serediň) laýyk gelýär.Ortaça τ.Köp ekspensial laýyklyk üçin gaty az foton öndüren ROI-ler derňewden aýryldy.Ulanylan kesiş, raf we nokatlar üçin 104 foton we damjalar üçin 103 foton boldy.Damjalaryň has pes çäkleri bar, sebäbi has ýokary intensiwlik bahalary bilen çüýremek egrilerini almak kyn, sebäbi şekil meýdanyndaky damjalar adatça kiçi we az bolýar.Analiz etmek üçin foton ýygnamak çäginden ýokary foton sanlary bolan ROI-ler (500 hasap / piksel bilen bellendi) hem taşlandy.Gyzyklanýan sebitden alnan intensiwlik çüýremek egrisini hyzmat möhletiniň başyndan iň ýokary 90% (çüýremegiň iň ýokary intensiwliginden soň) bilen deňeşdiriň, iň az IRF päsgelçiligini üpjün etmek bilen bir hatarda ähli intensiwlik çüýremegi üçin şol bir zady saklaň. sazlamalar Deňeşdirilen wagt penjiresi Deňizler we tegmiller üçin 25-50 ROI we damjalar üçin 15-25 ROI, azyndan 3 garaşsyz synagdan ýazylan 4-den gowrak nusgadan saýlanan suratlar derňeldi.Iki guýrukly t-synag, görnüşleriň arasyndaky ýa-da koakerwat ulgamlarynyň arasyndaky statistik tapawudy bahalandyrmak üçin ulanyldy.Ömrüň (τ) piksel-piksel derňewi üçin, her kanal üçin meýdanyň üstündäki ömrüň umumy bahasy hasaplandy we 2/3 komponentli ekspensial ýapyş modeliniň takmynan geçirilmegi geçirildi.Her piksel üçin ömrüň dowamlylygy, soňra hasaplanan τ bahalary ulanyp, pseudocolor FLIM laýyk şekilini döretdi.Guýruga laýyk ömrüň aralygy şol bir kanalyň ähli suratlarynda birmeňzeşdi we her çüýremek ygtybarly ýerleşdirmek üçin ýeterlik foton öndürýärdi.FRET derňewi üçin, 100 fotondan pes intensiwlik çägini ulanyp, pikseller ortaça 11 fotonyň fon signalyny (FBG) ulanyp saýlandy.Her kanalyň floresan intensiwligi synag arkaly kesgitlenen düzediş faktorlary bilen düzedildi: 69 spektral pyýada α 0,004, göni tolgunma 0.0 0.0305, kesgitlemegiň netijeliligi 0 0.517.Piksel derejesinde FRET netijeliligi soňra aşakdaky deňlemäni ulanyp hasaplanýar:
bu ýerde FDD donor (ýaşyl) kanalda görülýän floresan intensiwligi, FDA gytaklaýyn tolgunma astynda kabul ediji (gyzyl) kanalda görülýän floresan intensiwligi, FAA bolsa göni tolgunma astynda kabul ediji (gyzyl) kanalda görülýän floresan intensiwligi ( PIE).Floresan intensiwlik impulslary kanalda synlanýar).
100 µl LLPS reaksiýa çözgütlerini 25 µM bellikli monomerik Tau441 (25 µM αS bilen ýa-da bolmazdan) LLPS buferine (ýokardaky ýaly goşmaça) ýelmeýän folga örtügi we damjanyň emele gelmegi bilen 96 guýy mikroplata ýerleşdiriň, WF mikroskopiýasy barlanylandan soň deňagramlylyk.10 minudyň içindeOtag otagynda 48 sagat inkubasiýa edilenden soň, beloklaryň we tegmilleriň barlygy tassyklandy.Soňra guýularyň üstündäki suwuklygy seresaplylyk bilen aýyryň, soňra 50 L bölünme buferini (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) goşuň we 10 minut inkubasiýa ediň.Duzuň ýokary konsentrasiýasy LLPS-iň galyndy PEG sebäpli gaýtalanmazlygyny üpjün edýär we diňe elektrostatik täsirleşmeler netijesinde emele gelen belok ýygnamaklary söküler.Soňra guýynyň düýbi mikropipetanyň ujy bilen seresaplylyk bilen kesildi we emele gelen çözgüt boş gözegçilik guýusyna geçirildi.50 μM ThT bilen 1 sagatlap inkubasiýa edilenden soň, izolirlenen tegmilleriň barlygy WF mikroskopiýasy bilen barlandy.Sonikli αS fibrilleri PBS-de pH 7.4, natriý azid 0,01% 37 ° C we orbital sarsdyryjyda 200 rpm bilen 70 µM αS ergininiň 300 µl inkubasiýa edip taýýarlaň.Soňra çözgüt 9600 × g 30 minutda merkezden gaçyryldy, pellet PBS pH 7.4-de üýtgedildi we sonikasiýa edildi (1 minut, 50% sikl, Vibra-Cell VC130 sonikator, Sonics, Newton, ABŞ) fibril nusgalarynda kiçi süýümleriň deň ölçegli paýlanyşy bilen.
FCS / FCCS derňewi we iki reňkli tötänligi ýüze çykarmak (TCCD), PIE re usingimini ulanyp, FLIM-FRET mikroskopiýa synaglarynda ulanylýan şol bir MT200 wagt çözülen floresan konokal mikroskopda (Piko-Kwant, Berlin, Germaniýa) geçirildi.Bu synaglar üçin lazer güýji 6.0 µW (481 nm) we 6.2 µW (637 nm) goşuldy.Bu lazer kuwwatlarynyň utgaşmasy, iň amatly san derejesine ýetmekde we fotobleachingden we doýmakdan gaça durmak üçin ulanylýan jübüt floroforlar üçin şuňa meňzeş ýagtylygy öndürmek üçin saýlandy.Maglumat ýygnamak we derňew, täjirçilik taýdan elýeterli SymphoTime64 wersiýasy 2.3 programma üpjünçiligi (PicoQuant, Berlin, Germaniýa) ulanylyp geçirildi.
LLPS ulanyp alnan izolirlenen αS / Tau agregatlarynyň nusgalary izolýasiýa buferinde degişli monomolekulýar konsentrasiýa bilen seýreklenýär (adatça 1: 500 eritme, sebäbi agregatlar koakerwat nusgalaryndan izolýasiýa edilende eýýäm pes konsentrasiýalarda bolýar).Nusgalar gönüden-göni 1 mg / ml konsentrasiýasynda BSA ergini bilen örtülen örtüklere (Corning, ABŞ) ulanyldy.
Greenaşyl we gyzyl kanallarda PIE-smFRET derňewi üçin, monomer hadysalary sebäpli ýüze çykýan pes intensiwlik signallaryny süzmek üçin 25 fotondan has pes intensiwlik çäkleri ulanyldy (monomerleriň izolirlenen agregatlar bilen deňeşdirilende jemlenen nusgalardan köpdügine üns beriň).Bu çäk, seljeriş üçin agregatlary saýlamak üçin arassa monomer nusgalarynyň derňewinden alnan monomeriki αS-iň ortaça intensiwliginden bäş esse hasaplandy.PIE sürüjiniň zynjyry, TSCPC maglumatlary toplamak bilen bilelikde, fon we spektral geçelgäni ýok etmäge kömek edýän ömürlik agram süzgüçini ulanmaga mümkinçilik berdi.Aboveokardaky çäklerden peýdalanyp saýlanan alawyň intensiwligi, diňe bufer nusgalarynyň intensiwligi / binasy bilen ýüze çykýan gistogrammalardan kesgitlenen ortaça fon signalyny ulanyp düzedildi.Uly agregatlar bilen baglanyşykly partlamalar, adatça wagt yzynda yzygiderli birnäçe gap-gaç tutýar (1 ms).Bu ýagdaýlarda iň ýokary güýçli gap saýlandy.FRET we stohiometrik derňew üçin teoretiki taýdan kesgitlenen gamma faktor γ (0.517) ulanyldy.Spektral pyýada ýörelgesi we gönüden-göni tolgundyryş goşantlary ulanylýan tolgundyryjy lazer güýjünde ähmiýetsiz (synag arkaly kesgitlenýär).Partlamada FRET-iň netijeliligi we stoiometriýasy aşakdaky ýaly hasaplanýar.