347 poslamaýan polatdan örtülen turba himiki komponenti, biri-birine bagly köpçülik spektrometri (CLMS) ulanyp, interferona duýgur adam leýkosit antigen-A (HLA-A) çaperon beloklaryny kesgitlemek.

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.
Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.

Önümiň beýany

Poslamaýan polat 347L rulon turbalary, polat derejesi: SS347L

Interferon signalizasiýa ulgamy, daşky gurşawdan gelýän patogen we içerki patologiki signallaryň köpüsine güýçli sitokine jogap berýär, netijede interferon-ýokaşýan beloklaryň bölekleriniň induksiýasyna sebäp bolýar.Interferon bilen örtülen beloklaryň çäginde täze belok-belok täsirini kesgitlemek üçin DSS-töwekgelçilikli köpçülikleýin spektrometriýany (CLMS) ulandyk.Garaşylýan interferon-öçürip bolmaýan beloklardan başga-da, MX1, USP18, OAS3 we STAT1 ýaly kanoniki interferon-öçürip bolmaýan beloklaryň täze birek-birekli we öýjükli biri-birine bagly goşundylaryny kesgitledik.Bilelikdäki immunopripsitasiýa ulanyp, HLA-A beloklary (H2BFS-HLA-A-HMGA1) tarapyndan emele gelen interferon-induksion belok torlarynyň täze toplumyny ortogonal tassyklamaga we molekulýar dinamika modellemesini ulanyp, mundan beýläkki gözleglerine ünsi jemledik.Belok toplumynyň sazlaşykly dinamikasyny modellemek, CLMS tapyndylarynda kesgitlenen täsirleri görkezýän birnäçe täsir ediş ýerlerini ýüze çykardy.Bilelikde, interferon bilen ýüze çykan täze signalizasiýa toplumlaryny kesgitlemek üçin CLMS synag synagyny hödürleýäris we çişiň mikro-gurşawynda beloklaryň täsiriniň täze dinamikasyny kesgitlemek üçin CLMS-iň has giň ulanylmagyna garaşýarys.
Uýgunlaşdyrylan immun jogap başlamazdan ozal, öý eýesiniň dogabitdi gorag ulgamy, interferonlar (IFNs) diýlip atlandyrylýan gizlin alfa-dik sitokinleriň maşgalasy tarapyndan araçylyk edilýän mikroblara garşy jogap döredýär.I görnüşi IFNα IFNα we IFNβ öýjükli jogaplary işjeňleşdirýär, şol sanda wirusa garşy, proapoptotik, proýflammatiki we antiproliferatiw ýagdaýlar.Adamlarda IFNα-iň 13 görnüşi belli, hemmesi hromosoma 91-de jemlenendir. Geň galdyryjy zat, kliniki ulanmak üçin diňe IFNα2 öwrenildi.Recentlyakynda IFNα-iň beýleki görnüşleri boýunça gözleglere aýratyn üns berildi.Recentaňy-ýakynda geçirilen bir barlag, IFNα14-iň kanoniki IFNα2 görnüşi bilen deňeşdirilende HBV2 we AIW-13,4 köpeltmesini çäklendirmekde iň täsirli izoformlaryň biridigini görkezdi.
Işledilen I interferon reseptor toplumlarynyň (IFNAR1 we IFNAR2) usanus kinase TYK2 we JAK15,6 tarapyndan araçylyk edilen signal geçiriş kaskadyny herekete getirýändigi kesgitlenildi.Bu usanus kinoslary, fosforilat signal geçirijilerini we tiroziniň galyndylaryndaky transkripsiýa belok işjeňleşdirijilerini (STAT1 we STAT2) SH2 domen araçylyk heterodimerizasiýasyny başlatmak üçin6.Netijede, IRF9, ýadro görnüşine geçýän we 2000-den gowrak interferon-stimullaşdyrylan genleriň (ISG) transkripsiýasyna itergi berýän IFN-stimulirleýji faktor 3 geniň (ISGF3) trimeriki toplumyny emele getirmek üçin STAT heteroderlerini baglanyşdyrýar.
ISG-ler, esasanam wirus hüjümine jogap hökmünde dogabitdi immunitetiň oňurgasyny emele getirýär.Wirus ýokançlygyndan goramagyň ilkinji ugry hökmünde öýjükler öýjükli beloklaryň giň biologiki işjeňlik bilen çalt täsirini ýerleşdirýärler.Bu beloklara nagyş tanamak reseptorlary, signal beriji molekulalar, transkripsiýa faktorlary we göni wirusa garşy funksiýalary bolan beloklar, şeýle hem immun täsirleriniň negatiw sazlaýjylary9 degişlidir.ISG işjeňligi baradaky maglumatlaryň köpüsi, aýratyn ISG-leriň aňladylýan ýa-da saklanýan we işjeňligi dürli wiruslarda synag edilýän aşa aşa gysyş ekranlary 10,11 ýa-da gen dymdyrmak usullaryny (siRNA, RNAi we CRISPR) 12,13 ulanyp, işleýän ekranlardan gelýär.Bu gözlegler aýratyn ISG-leriň wirusa garşy häsiýetlerini kesgitlän hem bolsa, her ISG-iň esasy molekulýar mehanizmleri entek belli däl.Köp beloklaryň doly işjeňligi üpjün etmek üçin bir ýa-da birnäçe sitokin bilen täsirleşýändigi umumy kabul edilýär, şonuň üçin ISG-ler gönüden-göni täsir edýär ýa-da özara täsirleri öýjükli beloklar bilen araçylyk edilýär.Mysal üçin, ýaňy-ýakynda fotokross baglanyşdyrylan proteomika gözleginde, ATPase VCP / p97 esasy IFITM3 täsir ediji hyzmatdaş hökmünde kesgitlenildi, bu gadaganlyk lizosomal sortlaşdyryşda, dolanyşykda we IFITM3 wirus bölejikleri bilen kotransportda kemçiliklere sebäp bolýar.Immunopripsitasiýa ulanyp, wesikula bilen baglanyşykly belok bolan VAPA-ny, holesteriniň üsti bilen wirus ýetişmegine araçylyk edýän IFITM1 / 2/3 bilen özara hyzmatdaş hökmünde kesgitledik we bu hamyrmaýa iki gibrid ulgamy ulanyp, başga bir barlag bilen tassyklandy.Ylmy goldaw 15, 16.
Infectionokançlygyň we zyýanly üýtgeşmäniň öňüni almak bilen baglanyşykly esasy biologiki proses, esasy histokompatisiýa toplumy (MHC) molekulalary bilen araçylyk edilýän antigeniň görkezilmegi bolup durýar.Appedapylan, wagtyndan öň bes edilen ýa-da nädogry beloklardan peptidler (uzynlygy 8-12 aminokislotalar) MHC-I heterodimerine (MHC-I agyr we ýeňil zynjyrlardan ybarat, β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.Alnan durnukly MHC-I trimerleri öýjügiň ýüzüne daşalýar we öýjükli peptidleri CD8 + T öýjüklerine (sitotoksiki T öýjükleri) 17 görkezýär.T öýjükleri bu patogenleri we çişe mahsus antigen göterýän öýjükleri tanadýarlar we ýok edýärler.Netijede, patogenler we çiş öýjükleri immun gözegçiliginiň öňüni almak üçin köplenç antigen görkezişini basýarlar.Mundan başga-da, MHC-I adam çişleriniň 40-90% -de kadalaşdyrylýar we köplenç has pes çaklama bilen baglanyşykly19.
Patogenlere jogap bermek bilen baglanyşykly genler dynç alyş ýagdaýy bilen işjeň transkripsiýa arasynda çalt geçmeli.Şol sebäpden, gysga wagtyň içinde ýokary IFN islegine jogap bermek üçin birnäçe öýjükli beloklar çaklanylýar, 20,21 promouter hromatini üýtgetmek we üýtgetmek.Gözlegleriň köpüsi, IFN-iň gatnaşmagynda aýratyn ISG belok hyzmatdaşlaryny kesgitlemäge gönükdirildi.Model öýjük ulgamlarynda birnäçe proteomiki we transkriptomiki gözlegler IFN-iň öýjük landşaftyna täsirini düşündirdi.Şeýle-de bolsa, interferonlaryň döredýän dinamikasyna barha köp düşünýändigimize garamazdan, ISG-leriň gatnaşygy barada henizem az bilýäris.Interferon signalynyň çylşyrymlylygyna we wagta bagly dinamikasy göz öňünde tutulanda iki sorag ýüze çykýar: (i) çalt signalizasiýa gatnaşýan köp proteinli toplumlary durnuklaşdyrmak we duzamak mümkinmi we (ii) bu täsirleri 3D giňişligine düzüp bolarmy?
Bu meseleleri çözmek üçin, IFNα-den alnan beloklaryň özara täsir ulgamyny we onuň dinamikasyny öwrenmek üçin köpçülik spektrometri (CLMS) bilen birleşdirilen disuksinimid suberate-araçylyk himiki özara baglanyşyk (DSS) amala aşyrdyk.DSS beloklaryň we / ýa-da belok toplumlarynyň proksimal galyndylarynyň arasynda kowalent baglanyşyklary goşýar.Soňky MS derňewi, içerki baglanyşyk diýlip atlandyrylýan ýa-da özara baglanyşyk diýlip atlandyrylýan belok toplumlaryndaky subunitleriň belli bir belogyň içindäki giňişlik ýakynlygyny görkezýän anyk baglanyşyk ýerlerini ýüze çykarýar.Bu çemeleşmäni ulanyp, birnäçe täze belok-belok toplumlaryny, şeýle hem interferon bilen örtülen köp proteinli täsir ulgamlaryny kesgitledik.Bu täze özara täsirleriň bir bölegini barlamak bilen, H2BFS (H2B giston görnüşli FS; mundan beýläk H2B diýlip atlandyrylýar) we MDN1 HLA-A üçin hökmany hyzmatdaş hökmünde çykyş edýändigini görkezýäris.
Flo-1 öýjükleri özofagus adenokarsinomasynyň vitro modelleriniň biridir, sebäbi özofagus çişleriniň esasy aýratynlyklaryna meňzeýär22,23.Şeýle-de bolsa, çişleriň hemmesi immunogen däldir we Flo-1 öýjükleriniň interferon bejergisine jogap berýändigini ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin Flo-1 öýjüklerini 10 ng / ml IFNα bilen 72 sagat bejerdik.Flo-1 öýjükleri bejergiden 2 sagat soň başlap, 72 sagat dowam edip, IRF1-iň stasionar derejesiniň peselmegi bilen pSTAT1 we IRF1-iň irki induksiýasyny görkezdi (1A surat).ISG-leriň (MX1, IFITM1, OAS1 / 2 we ISG15) 6 sagatdan soň IFNα-e klassiki orta we giç faza jogaplaryny meňzeş edip, güýçli täsir edendigi anyklandy (1A surat).Bu maglumatlar bilelikde bu öýjükli modeliň interferon jogaplaryny öwrenmek üçin ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
IFNα bejergisinden soň Flo-1 öýjüklerinde diferensial belok aňlatma jogaplary.(A) 2, 6, 24, 48 we 72 sagatda 10 ng / ml IFNα bilen bejerilen Flo-1 öýjüklerinde beloklaryň görkezilmegi, görkezilen ISG antikorlaryny ulanyp immunoblot tarapyndan seljerildi.(B) Görkezilen wagtlar we konsentrasiýalar üçin DSS bilen birleşenden soň, öýjükli ekstraktlaryň gök reňkli SDS-PAGE jelleri.(C) Wekil immunoblot, beloklaryň özara baglanyşygynyň derejesini bahalandyrmak üçin şol bir nusgalardan p53 (DO-1) antikor bilen barlandy.
Situ belogynyň täsirleşiş landşaftyny ele almak üçin, membrananyň ýokary geçirijiligi we birneme gysga reaksiýa wagty sebäpli giňden ulanylýan birleşdiriji serişde DSS-ni ulandyk.Has gysga reaksiýa wagty biri-birine bagly beloklaryň uly agregatlarynyň emele gelmeginiň öňüni almaga kömek edýär we şeýlelik bilen birleşdirijiniň durnuklylygyny saklaýar.Iň amatly DSS konsentrasiýasyny kesgitlemek we biri-birine bagly bolmazlygy üçin ilki bilen öýjükleri degişlilikde 5, 10, 5 we 30 minutda 5, 2,5 we 1 mM DSS-e sezewar etdik we Coomassie reňkli SDS-PAGE lizatlaryny analiz etdik. (maglumatlar görkezilmeýär).Öýjükli lizatlar iň pes konsentrasiýada we iň gysga wagtda ýokary derejede biri-birine bagly bolup görünýär.Şonuň üçin DSS 5 minutda 1, 0,5 we 0,1 mM berildi (1B surat).0,5 mM DSS bilen iň amatly baglanyşyk 5 minutda syn edildi we IFNα bilen bejerilen öýjükler üçin bu şertler saýlandy.Mundan başga-da, 1C suratda belogyň özara baglanyşygynyň derejesini bahalandyrmak üçin p53 (DO-1) antikoryny ulanyp ýerine ýetirilen günbatar bölegi görkezilýär.
Flo-1 öýjükleri, baglanyşyk baglanyşygyny goşmazdan ozal 10 ng / ml IFNα bilen bejerildi.Kesgitlenen öýjükler soňra iki basgançakly proteoliz bilen lizelendi we beloklar FASP (2-nji surat) 24,25 gaýtadan işlenildi.Özara baglanyşykly triptiki peptidler köpçülik spektrometri arkaly derňeldi (2-nji surat).Soňra MS / MS spektrleri belok yzygiderliligine gabat gelýär we MaxQuant26,27 bilen kesgitlenýär.Çekilen peptidler, SIM-XL programmasyny ulanyp, alnan spektrlerden kesgitlenildi we aýry-aýry birleşmeler xQuest28 we SIM-XL29 açyk çeşme hasaplaýyş programma üpjünçilik turbalaryny ulanyp çylşyrymly tora birleşdirildi (2-nji surat).SIM-XL ýönekeý ýa-da çylşyrymly belok garyndylarynda belok-beloklaryň özara täsirini, içki zynjyrlary we aýratyn zynjyrlary kesgitleýär we belok gurluşlaryndaky täsirleri wizuallaşdyrmak üçin skriptleri üpjün edýär.Mundan başga-da, MS / MS29 spektr hiline görä her bir çyzgy salgysyny ID bal hökmünde görkezýär.Birnäçe ygtybarly belok-belok täsiri we toplumlary ýüze çykaryldy we molekulalar dinamikasyny (MD) modellemek (2-nji surat) 30, 31 ulanyp, immunopripsitasiýa we toplumlaryň sazlaşykly üýtgemelerini ulanmak arkaly täze özara täsirler barlandy.
CLMS usulyna shematiki syn.Flo-1 öýjükleri 10 ng / ml IFNα bilen 24 sagadyň dowamynda bejerildi, soň bolsa DSS-iň kömegi bilen situ belogyň özara baglanyşygy, soň bolsa öýjük lizisi we tripsinizasiýa edildi.Özara baglanyşykly nusgalar Orbitrap köpçülik spektrometriniň kömegi bilen derňeldi we LC-MS / MS döwründe peptid prekursorlarynyň böleklere bölünmegi üçin nusga alyndy.Alnan spektrlerden biri-birine bagly peptidleriň spektrini tanamak maşyny (SIM-XL) programmasy arkaly iki sany peptid kesgitlenildi we ähli birleşmeler hasaplaýyş turbalaryny ulanyp çylşyrymly tora birleşdirildi.Falsealan polo positiveitel dereje (FDR) ballary esasynda pes ynamly täsirleri süzüň.Birnäçe täze ýokary wepaly belok-belok täsiri bilelikde immunopripsitasiýa arkaly tassyklandy we molekulalar dinamikasy (MD) modellemek arkaly toplumlardaky üýtgeşmeler gözden geçirildi.
MaxQuant-yň degişlilikde stimulirlenmedik we stimulirlenen IFNα nusgalarynda jemi, 500 30.500 we, 5 28,500 peptid tapyldy (Goşmaça tablisa S1, 3A surat).Iki ýagdaýda-da peptidiň uzynlygy paýlanyşy, biri-birine bagly peptidleriň bardygyny görkezýän has uly peptidleriň has köp mukdaryny görkezdi (3B, C surat).Mundan başga-da, IFNα bilen bejerilen nusgalarda 40–55 aralygynda has uly peptidleriň köp bölegi bardy (3-nji surat).Log2 intensiwligine garşy beloklaryň kartalaşdyrylmagy, MX1, IFIT1 / 3, OAS2 / 3, DDX58 we HLA-F (3D surat) ýaly bejerilmedik nusgalar bilen deňeşdirilende, interferon bilen stimulirlenýän beloklaryň iň köp bolandygyny görkezdi.Reactome ýol maglumatlar bazasyny ulanyp, IFNα bejergisine jogap hökmünde üç esse köp baýlaşdyrylan beloklar üçin ýollaryň seljermesi, MHC-I-töwekgelçilikli antigeniň görkezilmegi we gaýtadan işlenişiniň iň esasy ýoludygyny görkezdi (3E surat).Öňki habarlara laýyk gelýän, OAS we ISG15 bilen araçylyk edilen wirusa garşy jogaplar, şeýle hem IFNα / β we sitokine duýduryşy işjeňleşdirilen ýollaryň arasynda.Mundan başga-da, SIM-XL ulanyp, ilkibaşda alnan MS / MS spektrinden lizine we serine mahsus beloklaryň özara baglanyşyklary kesgitlenildi.Recentaňy-ýakynda geçirilen bir barlagda 5 öýjük görnüşinde aýratyn ISG aşa aşa gysyş barlaglarynyň meta-seljermesi arkaly 9 wirus synpyndan 20 wirusy öz içine alýan 104 ISG habar berildi.Şeýle-de bolsa, uly maglumat bazalaryny barlamagyň hasaplama çäklendirmelerini ýeňip geçmek üçin, Padaria we başganyň habar beren IRDS genleriniň sanawynyň arasynda bolup biläýjek täsirleri öwrenmek üçin has kiçi maglumat toplumy bilen başladyk, köpüsi ISG-ler.
IFNα-e jogap hökmünde diferensial beýan edilen biri-birine bagly beloklary kesgitlemek (MaxQuant-dan alnan maglumatlar).(A) IFNα14 bejerilen we bejerilmedik Flo-1 nusgalarynda kesgitlenen umumy we aýratyn peptidleriň sanyny görkezýän Wenn diagrammasy.Bejerilmedik (B) we IFNα bejerilen (C) biri-birine bagly nusgalaryň peptid uzynlygy paýlanyşy.(D) Bejerilmedik we IFNα14 bejerilen Flo-1 öýjükleriniň arasynda log2 (LFQ intensiwligini) görkezýän ýylylyk kartasy.Çep panel IFNα-iň gatnaşmagynda iň işjeň işjeňleşýän beloklary görkezýär.(E) IFNα bejergisinden soň 20 sany baýlaşdyryş ýoluny görkezýän gistogramma.“Reactome” ýol maglumatlar bazasy, IFNα-jogap beriji beloklarda dört esse üýtgeşmäni derňedi.
Interferon-araçylyk ISG gyjyndyrmasy gowy dokumentleşdirilen, ýöne molekulalar derejesinde bu beloklaryň köp biologiki funksiýalara nädip ýetip biljekdigine gowy düşünilmeýär.Belli ISG-leriň arasynda ýokary derejede ynam bilen beloklaryň özara täsirini derňedik.Gyzykly tarapy, IFNα bejergisine jogap hökmünde uly toplum emele getirýän MX1, USP18, ROBO1, OAS3 we STAT1 beloklaryny öz içine alýan ulgamy kesgitledik (4-nji surat, S2 tablisa) 32,33,34.Iň esasy zat, bu täsirler IFNα bilen bejerilen üçlügiň hemmesinde tapyldy we bejerilmedik nusgalarda tapylmady, bu olaryň IFNα bejergisine jogap hökmünde döredilendigini görkezýär.STAT1-iň bu ISG-leriň aňlatmasyny transkripsiýa taýdan kadalaşdyrýandygy mälim, ýöne belok derejesinde ISG-ler bilen gatnaşygy öwrenilmedi.STAT1-iň kristal gurluşy, onuň dik domeniniň (CCD) ölçegler emele gelende DNK ýa-da protomerler bilen täsirleşmändigini görkezdi35.Bu α-heleller, özara täsirleşmek üçin esasan gidrofil ýer meýdanyny üpjün edýän dik gelix gurluşyny emele getirýär.CLMS maglumatlarymyzda, STAT1 bilen özara täsirleriň köpüsiniň KCD, baglanyşdyryjy domen ýa-da C terminaly guýrugy (galyndylary 700-708) öň SH2 domeninde bolup geçendigini gördük (4A surat).Öňki gözleg, USP18-iň STAT2-iň KCD we DNK baglanyşdyryjy domeni (DBD) bilen baglanyşýandygyny we I interferon signalynyň 24-nji signalynyň päsgelçiligini ara alyp maslahatlaşmak üçin I interferon reseptory IFNAR2-iň kiçi bölümine işe alnandygyny habar berdi.Şeýle hem, maglumatlarymyz USP18 katalitik domeniniň STAT1 DBD (4A surat, D) bilen täsirleşýändigini görkezdi, bu hem STAT1 bilen STAT2, USP18-i IFNAR2-e çekmekde rol oýnap biljekdigini görkezýär.
IFNα bilen bejerilen biri-birine bagly öýjüklerde belok-belok ISG ulgamy kesgitlenýär..Dürli şahsyýetleriň domenleri reňkleri bilen bellenýär32: MX1 domeni, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) we GED (569–660).OAS3 domenleri: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) we OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) we fn3 (777–864).STAT1 meýdanlary: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) we STAT1_TAZ2bind (715–739).)Özara baglanyşyk bosagasy 3,5 derejesinde kesgitlenildi.Nokat ýerleri, MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) we OAS3 (F) bilen STAT1 täsir ediş ýerlerini, şeýle hem iki peptidiň arasyndaky K ýa-da täsir ediş ýerlerini görkezýär.Suratda, baglanyşykdaky bal çäkleri 3.0-e bellendi.)STAT1 (pdb id: 1bf533) we OAS3 (pdb id: 4s3n34).) maksatnamasy.
Adamlarda USP18-iň iki izoformy, esasan ýadroda ýerleşýän doly uzynlykdaky belok we sitoplazmada we 36-njy ýadroda deň paýlanýan N-terminal domeni bolmadyk USP18-sf izoform beýan edildi.Mundan başga-da, N-termininiň gurluşsyz boljakdygy çaklanylýar we izopeptidaza işjeňligi ýa-da ISG1537 hökmany däl.Biziň gözlegimizde kesgitlenen özara täsirleriň köpüsi, beloklaryň N-terminasynda ýerleşip, bu täsirleriň doly uzynlykdaky USP18 (4A surat, D) degişlidigini we şeýlelik bilen ýadroda bolup biljekdigini görkezýär.Mundan başga-da, maglumatlarymyz N-termininiň belok-belok täsiri üçin ýöriteleşendigini görkezýär.IFNAR2 baglanyşyk meýdançasy 312-368 galyndylaryň arasynda ýerleşýär we bellemeli zat, toplumdaky beloklaryň hiç biri bu sebite bagly däldir (4A-njy surat) 37,38.Bilelikde alnan maglumatlar, IFNAR2 baglanyşdyryjy domeniň diňe reseptor belogy tarapyndan ulanylýandygyny görkezýär.Mundan başga-da, diňe OAS3 we ROBO1 N-terminusyň we IFNAR2 baglanyşdyryjy ýeriň ýokarky akymlary bilen baglanyşyklydygy anyklandy (4A surat).
ROBO1 transmembran signal beriji molekulalaryň immunoglobuline (Ig) maşgalasyna degişlidir we bäş sany Ig domeninden we öýjükden daşary sebitdäki üç fibronektin (Fn) domeninden durýar.Bu öýjükden daşary domenler membrana-proksimal sebit we bir transmembran gelix 39. Gurulmadyk öýjükli sebit C-terminusda ýerleşýär we effektor belogyny baglanyşdyrýan konserwirlenen yzygiderlilik sebäplerini öz içine alýar39.Aminokislotalardan 00 1100-den 1600-e çenli uzalyp gidýän sebit esasan tertipsizdir.MX1-iň ROBO1 bilen Ig, Fn we öýjükli domenler arkaly özara täsirleşýändigini gördük, STAT1 bilen özara täsirleriň köpüsi CCD, baglanyşdyryjy domen we ROBO1 C terminaly arasynda bolýar (4A, E surat).Beýleki tarapdan, DI, DIII we OAS3 baglanyşdyryjy sebitler bilen täsirler ROBO1 belogynyň hemme ýerinde paýlandy (4A-njy surat).
Oligadenilat sintaz (OAS) belok maşgalasy, öýjükli iki hatar RNK (dsRNA) kabul edýär we baglanyşdyrýar, sazlaşykly üýtgeşmeleri başdan geçirýär we 2 ′, 5′ bagly oligoadenilleri (2-5 As) 40 sintez edýär.Üç OAS-yň arasynda OAS3-iň dsRNA üçin iň ýokary ýakynlygy görkezýändigi we RNase L-i işjeňleşdirip bilýän we şeýlelik bilen wirusyň köpelmegini çäklendirip bilýän iň az 2-5 As sintez edýändigi anyklandy.OAS maşgalasy polimeraza beta (pol-β) görnüşli nukleotid geçiriş domenlerinden durýar.Öňki gözlegler, C terminaly domeniniň (DIII) katalitik işjeňliginiň OAS342 işjeňleşdirilmegi üçin zerur dsRNA baglanyşdyryjy domene (DI) baglydygyny görkezdi.OAS3-iň DI we DII domenleriniň KCD we SH2 bilen STAT1 TAD arasynda kiçijik birleşýän sebit bilen täsirleşýändigini gördük (4A surat, F).Belok gurluşynyň üstünde dürli baglanyşyk ýerleriniň üstüni ýapmak, list-DBD STAT1 aýlawy bilen OAS3-iň DI domeninde 60–75 galyndylardan emele gelen açyk jübü ýa-da boşlugyň arasyndaky täsirini ýüze çykardy (4G surat).Beloklaryň toplumdaky ugry, OAS3 bilen hiç hili täsiriň, DI domeniniň DNK baglanyşdyryjy ukybyna päsgel bermändigini görkezýär (S1A surat).Mundan başga-da, GTPase MX1-iň N terminaly domeni OAS3-iň DI we DIII domenleri bilen giňden täsir edýär (4A-njy surat).Şeýle hem, IFNα bejergisiniň üçüsinde-de OAS1 bilen MX1-iň arasyndaky täsirini gördük, bu ýerde bir OAS1 domeni (katalitiki taýdan işjeň) üç MX1 domeni bilen täsirleşdi (S2A, B surat).
MX beloklary, GTP-ni baglanyşdyrýan we gidrolizleýän N terminaly GTPase domenini, öz-özüňi ýygnamaga araçylyk edýän aralyk domeni we GTPase (LZ) hökmünde işleýän C terminaly leýk fermuarlaryny öz içine alýan dinine meňzeş GTPazalaryň uly maşgalasynyň bir bölegidir. ).domen effektory domeni25,43.MX1 wirusly genleriň transkripsiýasyny blokirlemek üçin wirus polimerazalarynyň kiçi bölümlerine baglanýar43.Öň habar berlen hamyrmaýa iki gibrid ekran, PIAS1 bilen baglanyşykly MX1, DNK bilen baglanyşykly işjeňligi blokirlemek bilen STAT1-töwekgelçilikli gen işjeňleşmesini saklaýar we SUMO E344,45 ligase işjeňligini görkezýär.Bu ýerde, MX1-iň STAT1 (4C surat, D) bilen baglanyşýandygyny görkezýäris, ýöne bu täsiriň IFNα-e jogap hökmünde STAT1-töwekgelçilikli gen işjeňleşmegine nähili täsir etjekdigi has giňişleýin öwrenilmeli.Mundan başga-da, MX1 IFNα bilen bejerilen üç gaýtalamanyň hemmesinde IFIT3 we DDX60 bilen täsirleşendigini gördük (S2C surat).
DDX60, IFN-e sebäp bolan sitoplazmatiki helikaza bolup, öň RIG-I wirusly RNA46-nyň garaşsyz zaýalanmagynda rol oýnapdy.RIG-I bilen täsirleşýär we signalyny baglanyşyk görnüşinde işjeňleşdirýär 46. DDX60 DEXD / H-Box helikaza domeninden we wirusly RNA we DNA47 baglanyşdyrýan C terminaly helikaza domeninden durýar.MX1 we IFIT3 bilen özara täsirleriniň köpüsi, kanoniki domenler ýa-da sebäpler bolmazdan uzyn N- we C terminaly sebitlerde bolýar (S2E, F).Şeýle-de bolsa, MX1 DEXD / H-Box helikaza domeni bilen baglanyşykly (S2E surat).IFIT maşgalasynyň beloklarynda tetrapeptidiň gaýtalanmagy (TPR) diýilýän özboluşly gelix-öwrüm-gelix motifiniň tandem nusgalary bar.IFIT3 RIG-I duýduryşynyň oňyn modulýatory we şonuň üçin MAVS toplumynyň bir bölegi hökmünde tapyldy.Maglumatlarymyz bilelikde alynsa, IFIT3 we DDX60 esasan IFIT3-iň TPR 3–6 aralygyndaky sebitde täsirleşýändigini we RIG-I / MAVS signalizasiýasynda rol oýnap biljekdigini görkezýär (S2F surat).
Proteinleriň hemmesini barlamagyň hasaplaýyş taýdan intensiwdigini göz öňünde tutup, IFNα bejergisiniň biriniň bolmagy üçin adamzadyň UniProt maglumatlar bazasyny barladyk.Bu göçürmede, HLA-A üçin birnäçe ygtybarly aragatnaşyk ulgamyny tapdyk.MS / MS spektrleri bilen kesgitlenen belok ýollarynyň seljermesi, MHC-I esasly antigeni gaýtadan işlemegiň we görkezmegiň interferon tarapyndan döredilen esasy ýoludygyny görkezdi (3D surat).Şol sebäpden, ähli baglanyşyk nusgalaryna ýokary derejede ynam bilen MHC-I molekulalarynyň belok täsirini öwrenmäge üns berdik.HLA α1, α2 we α3 domenlerden we ýeňil zynjyrlardan durýar we mikroglobulin β2 (β2m) hemişelik çaperon belogy 49.Endoplazmatiki retikulumda ýygnanandan soň, peptid ligandalary bolmadyk ýagdaýynda HLA durnuksyzdyr50.Peptid baglanyşdyryjy çukur, ýokary polimorf we gurulmadyk α1 we α2 domenlerden peptid däl görnüşde we has az polimorf α351 domeninde emele gelýär.IFNα-iň barlygynda iki sany HLA-A toplumyny tapdyk: biri HMGA1 we H2B (5-nji surat, S3 tablisa), beýlekisi MDN1, LRCH4 we H2B bilen täsirleşýär (6-njy surat).
IFNα H2B (H2BFS) we HMGA1 bilen HLA-A özara täsir ulgamyny döredýär...Dürli şahsyýetleriň domenleri reňkli kodlanan32: H2B (giston; 2-102) we MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 topar; 210–290 we MHC_I_C; 337–364).Özara baglanyşyk bosagasy 3,5 derejesinde kesgitlenildi.Nokat bölekleri H2B (B) we HMGA1 (C) bilen HLA-A täsir ediş ýerlerini, şeýle hem iki peptidiň arasyndaky K ýa-da täsir ediş ýerlerini görkezýär.Suratda, baglanyşykdaky bal çäkleri 3.0-e bellendi.(D) PyMOL programmasyndaky H2B, HLA-A we HMGA1 beloklarynyň gurluşlarynda görkezilen beloklaryň arasyndaky gatnaşyklar.Bu gurluşlar Phyre2 serweri (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ulanylyp, H2B, HLA-A we HMGA1 beloklary üçin şablon gurluşlary degişlilikde 1kx552, 1kj349 we 2eze55 boldy.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 we LRCH4 bilen HLA-A özara täsir ulgamyny döredýär.(A) 2D interaktiw kartada (SIM-XL programma üpjünçiliginde döredilen) tegelek hökmünde görkezilen öýjükli (gyzyl) we birek-birege (gök) baglanyşyklar.Özara baglanyşyk bosagasy 3,5 derejesinde kesgitlenildi.Dürli şahsyýetleriň domenleri reňkli kodlanan32: H2B (giston; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 topar; 210–290 we MHC_I_C; 337–364) we LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) we CH (535–641)).(B) PyMOL programmasyndaky H2B, HLA-A, LRCH4 we MDN1 beloklarynyň gurluşlarynda görkezilen beloklaryň arasyndaky gatnaşyklar.Bu gurluşlar, H2B, HLA-A, LRCH4 we MDN1 beloklary üçin 1kx552, 1kj349, 6hlu62 we 6i2665 şablon gurluşlary bilen Phyre2 serwerini (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ulanyp modellendi. degişlilikdeH2B (C), LRCH4 (D) we MDN1 (E) bilen HLA-A üçin K ýa-da özara täsirleşýän ýerleri görkezýän nokatlar.Otser bölekleri üçin kross-baglanyşyk balynyň çäkleri 3.0 boldy.
Genomyň bitewiligini saklamakdan başga-da, H2B gistony transkripsiýany kadalaşdyrmaga hem gatnaşýar.H2B belogy, aýlawlar bilen bölünen üç sany helel we 41,52 C terminaly guýrugy bilen emele gelen merkezi giston domeninden (HFD) durýar.H2B bilen özara täsiriň köpüsi, HFD heterodimeri bilen trimerizasiýany üpjün edýän α1 gelixde ýüze çykýar (5A, B surat).Lizinler DNK bilen baglanyşykly bolsa-da, käbir lizinler alternatiw asetilasiýa ýa-da metilizasiýa meýdançalarydyr.Mysal üçin, H2B-den K43, K46 we K57 galyndylary göni DNK baglanyşygyna gatnaşmaýar, ýöne transkripsiýadan soňky dürli üýtgeşmeleriň nyşanydyr53.Şonuň ýaly-da, H2B-de K44, K47 we K57 galyndylary, beýleki beloklar bilen täsirleşmegi goşmak bilen IFNα-iň barlygynda alternatiw rol oýnap biler (5A surat, B).Mundan başga-da, ekstrahromosomal giston H2B ýokanç serişdelerden ýa-da zeper ýeten öýjüklerden alnan iki hatar DNK (dsDNA) böleklerini ýüze çykarmak üçin sitosolik datçik hökmünde hereket edip, dürli öýjük görnüşlerinde immun täsirini işjeňleşdirýär54.DNK wiruslarynyň barlygynda H2B tükenmegi IFN-β önümçiligini we STAT154 fosforilýasiýasyny saklady.H2B, beýleki ýadro gistonlaryna garanyňda ýadrodan has çalt hereket edýändigi hem belli.MDN1 we LRCH4 bilen H2B täsirleri, saýlanan bejerilmedik nusgalarda-da syn edildi.HLA-A-nyň IFNα bejergisiniň üçüsinde we bejerilmedik bir gaýtalama nusgasynda H2B bilen täsirleşendigini gördük.Bu maglumatlar transkripsiýa düzgünleşdirmesinden garaşsyz alternatiw fiziologiki funksiýada H2B-iň roluny görkezýär.
HMGA1 (ýokary hereketli topar AT-Hook 1), keseli köpeldýän aminokislotalara baý kiçijik nukleoprotein, HLA-A bilen bilelikde kesgitlenildi.Kislotaly C terminaly guýrugy we AT çeňňekleri diýlip atlandyrylýan üç sany aýratyn DBD bar, sebäbi dsDNA55,56-da AT baý sebitiň kiçi çukuryna baglanýar.Bu baglanyşyk, DNK-nyň egilmegine ýa-da tekizlenmegine, kanoniki transkripsiýa faktorlarynyň ylalaşyk yzygiderliligine girmegine mümkinçilik berýär.C terminaly guýrugy, belok-belok täsirine we transkripsiýa faktorlaryny işe çekmäge gatnaşandyr öýdülýär, sebäbi C terminaly öçürmek mutantlary transkripsiýa başlap bilmeýär 57.Mundan başga-da, bu domen 58-nji kinazlar üçin belli substratlar hökmünde belli bolan birnäçe konserwirlenen fosforilýasiýa saýtlaryny öz içine alýar.C terminaly domeniň daşyndaky HMGA1 bilen HLA-A we H2B özara täsirini synladyk, C terminaly domeniň esasan transkripsiýa faktoryny baglanyşdyrmak üçin ulanylýandygyny öňe sürdük (5A surat, C).HMGA beloklary adapter DNK-ny baglanyşdyrmak üçin giston H1 bilen bäsleşýär we şeýlelik bilen elýeterliligi ýokarlandyrýar57.Şonuň ýaly-da, HMGA giston H2B bilen baglanyşdyryjy DNK boýunça giston H2B bilen täsirleşýän ýaly.HMGB1 HLA-A, -B we -C dendrit öýjüklerinde ýüze çykmagyna sebäp bolýar, olaryň işjeňleşmegine sebäp bolýar 59, ýöne HMG bilen HLA-nyň arasyndaky täsir öň habar berilmedi.HMGA1-iň HLA-A α1 we α3 domenleri bilen, 3 DBD-den başga täsirleriň köpüsi bilen täsirleşýändigini gördük (5A, C surat).Biziň elimizde HLA-A ýadroda lokallaşdyrylandygy anyklandy (maglumatlar görkezilmeýär) we H2B we HMGA1-iň hem ýadroda bardygyny göz öňünde tutup, bu täsir ýadroda bolup biler.H2B, HLA-A we HMGA1 arasynda ölçelýän aýratyn goşundylar 5D-nji suratda görkezilýär.
HLA-A-nyň beýleki beloklar bilen täsiri, onuň α1 we α2 domenlerinde we tertipsiz C terminaly domeninde bolýar (6-njy surat).Bu mysallaryň birinde HLA-A-nyň LRCH4-iň bozulan N terminaly guýrugy bilen täsirleşýändigini gördük (6A, D surat).LRCH4 TLR4 işjeňleşdirmesini we LPS sitokin induksiýasyny kadalaşdyrýar, şeýlelik bilen dogabitdi immunitetini 60,61 modulirleýär.Dokuz leýkine baý gaýtalanýan (LRR) we ektodomaininde rahatlandyryjy (CH) gomologiýa motiwli membranaly belok, soň bolsa transmembran domeni (TMD) 60, 62.CH domenlerinde belok-belok täsirleriniň 60-a araçylyk edýändigi habar berildi.LRR we CH domenleriniň arasynda takmynan 300 aminokislotalaryň uzynlygy birneme elýeterli, ýöne tertipsiz.Belok-belok torlarynyň we wezikulýar transportyň araçylary hökmünde bozulan sebitleriň işine esaslanyp, beloklaryň özara täsiriniň köpüsiniň bozulan sebitlerde ýüze çykýandygyny gördük.MDN1 bilen özara täsir, LRR1, LRR6, CH domenleri we tötänleýin sebitler ýaly belogyň uzynlygy boýunça paýlandy, H2B esasan CH domenine baglydy (6A, B surat).Ablyeri gelende aýtsak, özara gatnaşyklaryň hiç birinde CLMS çemeleşmesiniň aýratynlygyny görkezýän TMJ girmedi (6A, B surat).
MDN1 HLA-A belok ulgamynyň bir bölegi hökmünde hem kesgitlenildi (6A surat).AAA beloklar maşgalasyna (dürli işler bilen baglanyşykly ATPases) degişlidir.Bu, geksameriki halka gurnaýan we 60S 64 ribosomal subunitden gurnama faktoryny aýyrýan şol bir N-terminal AAA domeni.dineine 64,65,66 meňzeýär.Mundan başga-da, Asp / Glu baý sebitde MIDAS domeni (metal ionyna bagly ýer) bar.MDN1-iň uly göwrümi (takmynan 5600 aminokislotalar) we gowy öwrenilen beloklar bilen çäkli gomologiýasy sebäpli, onuň gurluşy we adamdaky işi barada az zat bilinýär.HLA-A, H2B we LRCH4-ni MDN1 baglanyşdyryjy hyzmatdaşlar hökmünde kesgitledik we PyMol-da belok toplumlary hökmünde ugruny açdyk (6A, B surat).Bu üç belok, AAA domeni, dinine meňzeş baglanyşdyryjy domen we ähtimal MIDAS MDN1 domeni bilen täsirleşýär.Öňki hasabatda çeňňek beloklarynyň ýakyn arassalanmagy MDN1-ni giston H2B67 bilen baglanyşykly belok hökmünde kesgitledi.Mundan başga-da, ýaňy-ýakynda geçirilen bir barlagda, netijelerimizi goldaýan, ýakynlygy arassalanan köpçülik spektrometriýasyny ulanyp, HCT116 öýjüklerinde MDN we HLA-B arasyndaky özara täsir barada habar berildi68.IFNα bilen bejerilen nusgalarda bu toplumyň kesgitlenmegi, interferon signalizasiýasynda MDN1-iň roluny görkezýär.
HLA genleriniň ýokary polimorf bolandygy sebäpli, Flo-1 öýjükleriniň RNK yzygiderli maglumatlaryndan HLA-A, -B we -C kartalaşdyryş okaýyşlaryny çykardyk (maglumatlar görkezilmeýär).Peptid yzygiderliligi yzygiderli okalmagyna laýyk gelýän HLA-A, -B we -C arasynda HLA-A-da biri-birine bagly peptidleriň ýerleşýän sebitlerinde düýpli tapawutlary ýüze çykardy (S3-nji surat).Mundan başga-da, HLA-B / C molekulalarynyň H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 beloklary bilen belok bilen beloklaryň özara baglanyşygyny görmedik.Bu, HLA-A, MDN1, LRCH1 we HMGA1 arasynda tapylan beloklaryň özara täsiriniň HLA-A mahsusdygyny görkezýär.Mundan başga-da, biri-birine bagly bolmadyk nusgalaryň proteomiki derňewi (S4 Tablisa) HLA-A-nyň HLA-B ýa-da HLA-C bilen deňeşdirilende has yzygiderli yzygiderliligini görkezdi.HLA-A üçin kesgitlenen peptidler, IFNα bejergisinde we bejerilmedik nusgalarynda ýokary intensiwlikde boldy.
Bu ýerde ýüze çykarylan özara täsirleriň iki belokyň ýakyn giňişlikde biri-birine bagly bolmazlygy sebäpli däldigini anyklamak üçin, immunopripsitasiýa barlaglaryny ýerine ýetirip, iki sany täze HLA-A täsir ediji faktory tassykladyk.Endogen MDN1 we H2B bilen HLA-A täsirleri IFNα bejergisinde we bejerilmedik Flo-1 öýjüklerinde ýüze çykaryldy (7-nji surat, S4 surat).HLA-A-nyň immunopripsitlerde H2B tarapyndan tutulandygyny we bu birleşigiň IFNα bejergisi bilen baglanyşyklydygyny tassykladyk, sebäbi bejerilmedik öýjüklerden immunopripsitasiýa nusgalarynda HLA-A ýokdy (7A surat).Şeýle-de bolsa, maglumatlarymyz IFNα-iň H2B we MDN1 bilen baglanyşygy bolan HLA-A-ny diferensial tertipleşdirýändigini görkezýär.IFNα H2B bilen HLA-A arasynda birleşme döredýär, ýöne MDN1 bilen baglanyşygyny azaldar.Dolandyryşda MDN1-iň HLA-A bilen baglanyşyklydygyny gördük we IFNα goşulmagy IFNα tarapyndan MDN1 induksiýasyna garaşsyz bu täsiri azaldy (7B, C surat).Mundan başga-da, HLA-A immunopripsitasiýa H2B-ni A549 öýjüklerinde aldy (S4-nji surat), bu täsiriň öýjük görnüşine bagly däldigini görkezýär.Bu netijeler, HLA-A-nyň H2B we MDN1 bilen interferon-araçylyk täsirini goldaýar.
HLA-A H2B we MDN1-ni arassalaýar.Wekil endogen H2B (A) we MDN1 (B) immunoblotlary IFNα bejergisi bolan Flo-1 öýjüklerinden immunitet aldy we görkezilen antikorlary barlady.Negativearamaz gözegçilik hökmünde syçan we towşan IgG ulanyldy.(C) Dürli antigenleriň otnositel mukdary (giriş) görkezilen antikorlara garşy barlanan immunoblotlar bilen şekillendirilýär, β-aktin ýük gözegçiligi hökmünde ulanyldy.
Interferon bilen örtülen ýokary ygtybarly biri-birine bagly torlaryň biri bolan H2B-HLA-A-HMGA1-iň gurluş aýratynlyklary derňeldi.Bu toplum bilen baglanyşykly beloklaryň sazlaşykly dinamikasyna düşünmek üçin alternatiw çemeleşme hökmünde molekulýar dinamika modellerini ulandyk (8-nji surat).CLMS maglumatlaryndan alnan maglumatlar, H2B, HLA-A we HMGA1 beloklarynyň dürli gabat gelmeginiň mümkindigini görkezýär.Şonuň üçin aşakdaky potensial toplumlar çözüji gurşawda modellendi: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A we H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molekulýar işleýiş gurşawy; Himiki hasaplaýyş topary Inc., Monreal, Kwebek, Kanada) bukjasyny ulanyp, belok-belok dokma ekrany bu beloklaryň arasynda tapawut bolup biläýjek teklipleri teklip etdi (8A-njy surat).Doklaýyş belok toplumynyň wizuallaşdyrylmagy birnäçe özara täsirleri we bolup biläýjek ylalaşyklary ýüze çykardy (5A, 8-nji surat).Şeýlelik bilen, mümkin bolan bir üýtgeşiklik 8A suratda görkezilýär (bellikli kesişmeler bilen) we MD modelleşdiriji turbanyň kömegi bilen hasam baha berildi.Mundan başga-da, H2B ýa-da HMGA1-ni HLA-A bilen baglanyşdyrmak, H2B-iň HLA-A üçin has ýakynlygyny görkezýär (8A-njy surat).
H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A we H2B-HLA-A-HMGA1 toplumlarynyň arasynda bolup biljek torlaryň sazlaşykly dinamikasy.(A) Çep panel, içerki (gyzyl) we birek-birek (gök) baglanyşyklaryň 2D kartasy (SIM-XL programma üpjünçiliginde döredilýär).Mundan başga-da, kesgitlenen birleşdiriji galyndylar H2B, HLA-A we HMGA1 beloklarynyň gurluşlaryna bellik edilýär.Bu beloklaryň baglanyşykly konfigurasiýalary, MOE bukjasynda ýerine ýetirilen dok geçirijisiniň kömegi bilen alyndy.Çep aşaky panelde dürli belok-belok baglanyşygy bolan (GBVI / WSA dG; kkal / mol) H2B-HLA-A we HMGA1-HLA-A toplumlarynyň dürli bolup biläýjek görnüşleri görkezilýär.(B) Her belok gurluşy üçin atom pozisiýalarynyň (wodorod atomlaryndan başga) standart gyşarmasy (RMSD).(C) Dürli dowamlylygy ≥ 10 ns-ni göz öňünde tutup, dürli simulirlenen toplumlardan birek-birege belok-belok wodorod baglanyşygy.H-bond donor-kabul edijiniň kesiş aralygy 3,5 Å, donor-H-kabul edijiniň kesiş burçy ≥ 160 ° –180 ° derejesinde kesgitlenildi.(D) HLA-A-H2B we HLA-A-HMGA1 toplumlaryndan alnan ≥ 20 ns aralygyndaky öz hyzmatdaşlary bilen belok-belok täsirini emele getirýän bellikli galyndylar.Belok gurluşlary ortaça 100 ns MDS gurluşyny görkezýär.:Toplumlar / HMGA1-HLA-A / H2B-HLA-A-HMGA1.Özara baglanyşyklara baha bermek üçin bosaganyň bahasy 3.0, MDS-den ns 10 ns alýan aýratyn täsirleri hasaba alyndy.Belok gurluşlary BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, ABŞ) we Molekulýar iş gurşawy (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreal, Kwebek, Kanada) paketleri arkaly şekillendirildi.
Wagtyň geçmegi bilen HLA-A molekulalarynyň durnuklylygy (standart gyşarmak; RMSD ýa-da standart gyşarmak; RMSF) toplumlarda H2B ýa-da HMGA1 beloklarynyň bolmagy HLA-A durnuklaşandygyny görkezýär (8B surat, S5 surat).HMGA1 belogy, HLA-A-nyň B2M saýty bilen berk baglanyşýar, HLA-A-HMGA1 ýa-da H2B-HLA-A-HMGA1 toplumynda HLA-A aminokislotalaryň durnuklylygyny üpjün edýär (8B surat, S5 surat).hususan-da, H2B (FIG. 8B) barlygynda HLA galyndylary ~ 60-90 we ~ 180-210 has çeýe tapyldy.H2B we HMGA1, H2B ýa-da HMGA1 bilen baglanyşdyrýan HLA-A bilen deňeşdirilende, H2B-HLA-A-HMGA1 toplumynda HLA-A bilen has oňat baglanyşyk görkezdi (8C surat, D; S5 tablisa).Wodorod baglanyşygyna gatnaşýan galyndylar (MD modelli ýokary tutum ≥ 10 ns) toplumdaky CLMS täsir ediş meýdançalaryna (K ýa-da S galyndylary) gabat gelýär, bu bolsa CLMS tarapyndan kesgitlenen täsirleriň gaty ygtybarlydygyny görkezýär.Ygtybarlylyk (8E-nji surat).CLMS we MD modellerinde HLA-A takmynan 190-210 bilen 200-220 töweregi aminokislotalaryň galyndylary degişlilikde H2B we HMGA1 baglanyşdyrýar (FIG. 8E).
Belok-belok täsiri, belli bir gyjyndyrmalara jogap hökmünde öýjükli aragatnaşygy ara alyp barýan dinamiki gurluş torlaryny emele getirýär.Proteomikanyň köp çemeleşmesi, belogyň umumy durnukly ýagdaýynyň üýtgemelerini ýüze çykarýandygy sebäpli, belok-beloklaryň özara täsir dinamikasy, baglanyşyk interfeýslerini almak üçin goşmaça gurallary talap edýär we CLMS şeýle gurallaryň biridir.Interferon duýduryş ulgamy, öýjüklere daşky gurşawyň patogen we içerki patologiki signallaryna jogap bermäge mümkinçilik berýän sitokin torudyr, netijede interferon-ýokaşýan beloklaryň bölekleriniň induksiýasy bilen tamamlanýar.Interferon bilen örtülen beloklaryň bir toparynyň arasynda täze belok-belok täsirleriniň kesgitlenip bilinjekdigini kesgitlemek üçin CLMS-i ulanýardyk.Belok toplumlaryny almak üçin interferona jogap berýän Flo-1 öýjük modelinde global beloklaryň birleşdiriji derňewi ulanyldy.Bir-birine bagly bolmadyk we biri-birine bagly öýjüklerden triptiki peptidleriň çykarylmagy, kesgitlenen LFQ intensiwligi bilen peptidleri sanamaga, ýoly baýlaşdyrmaga we peptidiň uzynlygyny paýlamaga mümkinçilik berýär.Kanoniki interferon-öçürip bolmaýan beloklar polo positiveitel içerki gözegçilik hökmünde kesgitlenildi, MX1, UP18, OAS3 we STAT1 ýaly kanoniki interferon-öçürip bolmaýan beloklaryň täze birek-birek we öýjükli birleşdiriji goşundylary syn edildi.Funksiýa ugurlarynda dürli gurluş aýratynlyklary we özara täsirler derňeldi.
HLA-A, MDN1 we H2B arasyndaky özara täsir, IFNα bilen bejerilen we bejerilmedik Flo-1 we A549 öýjüklerinde immunoblotting arkaly ýüze çykaryldy.Netijelerimiz, HLA-A-nyň H2B bilen IFNα garaşly görnüşde toplumlarynyň bardygyny görkezýär.Biziň işimiz, bu iki toplumyň bilelikde lokalizasiýasyny has giňişleýin öwrenmek üçin gyzykly bir ýoly görkezýär.Öýjük görnüşine garaşsyz interferon-araçylyk beloklaryň täsirini kesgitlemek üçin CLMS çemeleşmesini öýjük çyzyklarynyň paneline giňeltmek gyzykly bolar.Netijede, H2BFS-HLA-A-HMGA1 toplumyna gatnaşýan beloklaryň sazlaşykly dinamikasyna düşünmek üçin alternatiw çemeleşme hökmünde MD modelini ulandyk, öýjükli we birek-birekli gepleşikleri yzarlaýan.CLMS maglumatlaryndan alnan maglumatlar, H2BFS, HLA-A we HMGA1 beloklarynyň dürli gabat gelmeginiň mümkindigini görkezýär.Bu dokma belok toplumlarynyň arasynda bolup biläýjek dürli ylalaşyklar, CLMS maglumatlar bazasynda görkezilenlere meňzeş birnäçe täsiri ýüze çykardy.Usulymyzyň esasy güýçli taraplaryndan biri, HLA ýaly ýokary polimorf genleri özara baglanyşdyrmagy aňsat kesgitlemäge mümkinçilik berýär, şonuň üçin öwrenmek kyn bolan HLA gaplotipine mahsus beloklaryň özara täsirini öwrenmek gyzykly bolar.Maglumatlarymyz bilelikde alnanda, CLMS-iň interferon bilen öçürilen signal ulgamlaryna düşünişimizi giňeltmek we çiş mikro-gurşawynda has çylşyrymly öýjükli ulgamlary öwrenmek üçin esas bolup biljekdigini görkezýär.
Flo-1 öýjükleri ATCC-den alyndy we DMEM-de (Gibco) 1% penisillin / streptomisin (Invitrogen), düwünçegiň 10% düwünçegi (Gibco) bilen dolduryldy we 37 ° C we 5% CO2 derejesinde saklandy.Inkubasiýa.Öýjükler IFNα14 (Edinburg belok önümçilik kärhanasy tarapyndan öndürilýär) bilen bejerilmezden ozal 70-80% aralykda ösdi.Otherhli beýleki himiki maddalar we reagentler, başgaça bellenilmedik bolsa, Sigma Aldrihden satyn alyndy.
Flo-1 öýjükleri 6 guýy tarelkada ösdürilip ýetişdirildi we ertesi gün öýjükler 10 ng / ml IFNα14 bilen 24 sagadyň dowamynda takmynan 80% aralykda bejerildi.Öýjükler PBS bilen üç gezek ýuwuldy we täze taýýarlanan DSS (Termo Fisher Scientific) (DMSO-da eredildi) bilen PBS-de 5 minut 37 ° C-de iň soňky konsentrasiýasyna 0,5 m çenli jemlendi.DSS biri-birine baglanyşyk reaksiýasy PBS bilen çalşyryldy we galyndy DSS 37 ° C-de 15 minutda 20 mM Tris (pH 8.0) goşmak bilen söndürildi.Öýjükler döwmek arkaly ýygnaldy we pes baglaýjy turbalarda (Kislorod) ýygnaldy.
Öýjük bölejigi, otag temperaturasynda wagtal-wagtal titremek bilen 300 µl karbamid liz buferi (8 M karbamid, 0,1 M Tris, pH 8.5) bilen lizelendi.Centhli merkezden gaçyryş ädimleri 14,000 xg 8 ° C-de ýerine ýetirildi.Lizaty 10 minut merkezden gaçyryň we adatdan daşary tebigaty täze turba geçiriň.Galan açyk bölejikler, ikinji liz buferiniň (2 M karbamid, 2% (w / v) SDS (natriý dodekil sulfat)) birmeňzeş suw ergini alynýança 30 minut ýa-da ondanam köp eräpdir.Lizat 20 minut merkezden gaçyryldy we adatdan daşary tebigat öňki ädimde alnan lizat bilen garyndy.Belok konsentrasiýalary öndürijiniň mikroplat amallary boýunça görkezmesine laýyklykda Micro BCA barlagy (Thermo Fisher Scientific) ulanylyp baha berildi.Nusgalar suwuk azotda çalt doňduryldy we -80 ° C derejesinde saklandy.
Takmynan 100 μg ereýän biri-birine bagly belok, Wisniewski we başganyň düşündirişi ýaly üýtgedilen süzgüç nusgasy taýýarlyk protokoly (FASP) ulanylyp gaýtadan işlenildi.69 Gysgaça, belok 200 µl karbamid buferi (0,1 M Trisde 8 M karbamid, pH 8.5) bilen baglanyşdyrylýar, worteksed we ýarym.Centhli sentrifugasiýa ädimleri 25 ° C-de 14,000 xg ýerine ýetirildi.Özara baglanyşykly belok lizatynyň birinji ýarymy Ultracel-10 membranasy (Merk) bilen enjamlaşdyrylan 10 kDa Mikrokon merkezden gaçyryş süzgüç enjamyna geçirildi, soňra süzgüçde 25 minut merkezden gaçyryş çäresi geçirildi.Soňra süzgüçde belogyň ikinji ýarymyny goşuň we şol ädimleri gaýtalaň.Beloklary dikeltmek karbamid buferine 100 ml 17 mM tris (2-karboksietil) fosfin gidrokloridini (TCEP) goşmak arkaly amala aşyryldy.Dikeldiş termikserde 600 aýlawda 37 minutda 30 minutda garyndy.Mundan başga-da, sütün merkezden gaçyryldy we azalýan biri-birine bagly belok karbamid buferinde 100 m 50 ýodoasetamidiň 100 μl ulanylyp alkilleşdirildi.Alkilasiýa reaksiýasy garaňkyda 20 minut otag temperaturasynda geçirildi.Sütüni aýlaň, sütün diwarlaryny 100 µl karbamid buferi bilen 3 gezek ýuwuň, soňra sentrifuga.Şol operasiýa 100 m ammiak bikarbonatdan 100 μl ulanyp, 3 gezek geçirildi.Tripsinizasiýa etmezden ozal, kolleksiýa turbasyny täzesi bilen çalyşyň.50 m ammiak bikarbonat we tripsin buferinde (Promega) suwuklandyrylan 1 µl tripsin bolan iýmit siňdiriş buferini goşuň.Tripsiniň beloga bolan gatnaşygy takmynan 1: 33-de saklandy we iýmit siňdiriş reaksiýalary bir gije çygly kamerada 37 ° C inkubasiýa edildi.Özara baglanyşykdaky peptid süzgüçden 25 minut sentrifugasiýa bilen çykaryldy.Peptidiň dikeldilmegi süzgüçde 50 μl 0,5 M NaCl goşup, 25 minut sentrifugasiýa bilen gowulaşdy.
C18 Micro Spin sütünleri (Garward Apparat), Bouchal we al.70 tarapyndan ownuk üýtgeşmeler bilen beýan edilen teswirnamadan soň biri-birine bagly triptiki peptidleri duzlamak üçin ulanyldy.Gysgaça, C18 aýlaw sütünleri asetonitril (AcN) (Merk) -de 0,1% formik kislotany (FA) üç ýuwmak we 0,1% FA iki ýuwmak bilen işjeňleşdirildi.Sütün 15 minut üçin 0,1% FA bilen gidratlandy.Nusgalary aýlaw sütünlerine ýükläň we 0,1% FA bilen 3 gezek ýuwuň.Süýjedilen peptidler 0,1% FA-da 50%, 80% we 100% AcN ulanyp, basgançakly gradient bilen yzygiderli çykaryldy.Nusgalar, galyndy suwuklyk doly ýitýänçä, SpeedVac Plus konsentratorynda (Eppendorf) guradyldy.Uzaldylan peptidler 100 μl 0,08% trifloroasetik kislotada 2,5% AcN-de eritildi we konsentrasiýalar NanoDrop 2000-de ölçenildi (Termo Scientific).LC-MS / MS ulgamyna her nusga üçin takmynan 1 μg biri-birine bagly peptid sanjym edildi.
Özara baglanyşykly peptidler “Orbitrap Exploris 480” köpçülik spektrometrine (Termo Scientific) birikdirilen UltiMate 3000 RSLCnano LC ulgamynda (Termo Scientific) bölünipdi.Çekimli peptidler 300 µm ID, 5 mm uzynlykdaky C18 sütün sütüninde C18 PepMap100 sorbent we 5 µm PepMap sorbent (Termo Scientific) bilen ýygnaldy.2,5% AcN-de erän 5 µl / min 0.08% trifloroasetik kislotada nasos akymyny ýükläň.Çekimli peptidler, içki diametri 75 μm we uzynlygy 150 mm bolan analitiki birleşdirilen kremniniň sütüninde 2 μm PepMap sorbenti bilen dolduryldy (Termo Scientific).A we B ykjam fazalary degişlilikde suwda 0,1% FA we asetonitrilde 0,1% FA-dan ybaratdy.Gradient 2,5% B-den başlaýar we 90 minutda 40% B-e, soňra bolsa indiki 2 minutda 90% B-e çenli ýokarlanýar.Ykjam fazanyň düzümi 10 minutda 90% B derejesinde saklandy we 2 minutda çyzykly ýagdaýda 2,5% B çenli azaldy.Sütün indiki aýlawdan 8 minut öň 2,5% B deňleşdirildi.Analitik sütünden çykarylan biri-birine bagly peptidler nanoelektrospraý ionlaşdyrma (NSI) çeşmesinde ionlaşdyryldy we Exploris 480 köpçülik spektrometrine (Termo Scientific) sanjym edildi.
“Orbitrap Exploris 480” köpçülik spektrometri polo positiveitel korrelýasiýa re iniminde işledi.Doly skaner, m / z 350 Th-dan m / z 2000 Th aralygynda aralyk sazlamalary bilen 120,000 durulykda bölüm re modeiminde geçirildi.Kadalaşdyrylan AGC maksady, iň ýokary giriş wagty 50ms bilen 300% -de kesgitlenildi.Peptidler üçin monoizotopiki pik kesgitlemesi döredildi.Çäklendiriji dynç alyş parametri gaty az prekursor tapylsa dogry bolar.Prekursoryň iň az ion güýji 5.0e3, deslapky zarýad ýagdaýlary bolsa synaglara +8 çenli girizildi.
Maglumat korrelýasiýa re modeiminde esasy skanerleriň arasyndaky aýlaw wagty 2,5 sekuntda kesgitlenildi.Dinamiki köpçülikleýin çykaryş, deslapky ionyň birinji böleklerinden soň 20 s.Öňünden izolýasiýa penjiresi 2 Th.Kesgitli çaknyşyk energiýa re withimi bilen kadalaşdyrylan çaknyşyk energiýasynyň görnüşi, maglumatlara bagly MS / MS skanerinde saýlandy.Çaknyşyk energiýasy 30% -e deň boldy.“Orbitrap” çözgüdi 15 000, AGC maksady bolsa 100% kesgitlenildi.Adaty iň ýokary sanjym wagty 60 millisekuntda kesgitlenýär.
Özara baglanyşykly nusgalarda belok-belok toruny yzarlamazdan ozal, nusgalarda yzarlanylýan peptidleri / beloklary kesgitlemek üçin MaxQuant paketini (1.6.12.0 wersiýa) 26,27 ulanyp, çig faýllary gaýtadan işledik.Mundan başga-da, IFNα bilen bejerilen we bejerilmedik baglanyşyksyz Flo-1 nusgalarynda şuňa meňzeş proteomiki derňewler geçirildi.MS / MS maglumatlary UniProt adam maglumatlar bazasynda (www.uniprot.org) gözledi (2020-nji ýylyň 12-nji awgustynda ýüklendi, 75 093 ýazgy bar) içindäki Andromeda27 gözleg motoryny ulanyp.Gözleg fermentiň aýratynlygyny we deamidasiýanyň (N, Q) we okislenmäniň (M) dürli üýtgemelerini görkezmezden geçirildi.Öňünden gelýän köpçülikleýin çydamlylyk 20 ppm-de, önüm ionlary 0.02 Da derejesinde kesgitlenildi.Ilkinji we iň köp köpçülikleýin gyşarmak 10 ppm-a düzüldi.Peptidiň iň ýokary massasy 4600 Da, yzygiderliligiň meňzeşligi 7-25 aminokislotalar (aa) arasynda kesgitlenildi.Goşmaça statistiki derňew Perseus programmasynyň kömegi bilen geçirildi (1.6.10.45 wersiýa).Beloklaryň mukdary belogyň spektral intensiwligini kadalaşdyrmak bilen hasaplandy (LFQ intensiwligi; bellik edilmedik mukdar) 27 we intensiwlik bahalary Log2-e öwrüldi.Peptid intensiwligi bilen kesgitlenen beloklaryň iýerarhiki toparlanyşygy R (v 4.1.2) pheatmap (v1.0.12) paketiniň kömegi bilen guruldy.Wayol baýlaşdyryş derňewi, bejerilmedik nusgalar bilen deňeşdirilende dört esse işjeňleşdirilen IFNα bejergisi bolan beloklar üçin Reactome ýol maglumatlar bazasynyň kömegi bilen geçirildi.
LC-MS / MS tarapyndan gözegçilik edilýän belok toplumlarynyň lizin (K) ýa-da serin (S) aýratyn himiki baglanyşyklaryny kesgitlemek, biri-birine bagly peptidler (SIM-XL) 29 üçin spektroskopiki kesgitleýji enjam (SIM-XL) ulanylyp geçirildi.Ilki bilen, Padariya we başgada beýan edilen IRDS belok maglumatlar bazasy arkaly interferon bilen baglanyşykly (IFN) DNK zeper ýetmegine garşylyk goly (IRDS) genleriniň arasynda bolup biläýjek täsirler derňeldi.“UniProt” -yň ähli şertlerini we gaýtalanmalaryny barlamak hasaplaýyş taýdan gaty güýçlidir, şonuň üçin IFNα bejergisine garşy adamzadyň UniProt maglumatlar bazasy (www.uniprot.org) (2020-nji ýylyň 12-nji awgustynda göçürildi, 75 093 ýazgy bar).Trustokary ynamly täsirler üçin süzgüçlerden biri.Alnan bu ýokary ähmiýetli täsirler giňeldildi we ähli gaýtalanmalarda we şertlerde synag edildi.
SIM-XL-de DSS biri-biri bilen baglanyşdyryjy (XL) üçin ulanyldy we XL agram çalşygy we üýtgetmek agramy degişlilikde 138.06 we 156.07 boldy.Aşakdaky biri-birine bagly reaksiýa saýtlary göz öňünde tutulýar: KK, KS we KN-TERM, habarçy ionlary bolmazdan.Öňünden gelýän we bölek ppm ikisi 20, Xrea bosagasy 0,15 bellendi.Trypsin düýbünden mahsus hasaplandy we ýokary energiýaly C-duzak (HCD) böleklemek usuly durmuşa geçirildi.XCorr dinamiki DB azaltmak çäkleri we dinamiki DB azaltmak üçin iň az peptid mukdary degişlilikde 2,5 we 2 hökmünde kesgitlenildi.Beýleki parametrler: monoizotop ähtimallygy we iň ýokary tötänlik kesilmegi, her setir üçin iň az 4 AA galyndy we iň ýokary zarýad zarýady we 3 sany maxima bölünen bölek.Alnan 2D kartalar (SIM-XL) derňeldi we 2D kartalary gurmak üçin xQuest28 grafiki şekillendiriş ulanyldy.Belok gurluşlaryndaky beloklaryň baglanyşyklary PyMol-da (PyMOL Molekulýar Grafika Ulgamy, 2.0 Schrödinger, LLC) berilýär.
Belok model gurluşlary, Phyre2 serweri (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ulanyp, gomologiýa modellemek we “Gizlin Markow usuly” ýörelgelerini ulanyp döredildi.Phyre2 belli belok gurluşlary bilen yzygiderlilige esaslanýan model gurluşlaryny döredýär.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 we MDN1 beloklary üçin 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 we 6i2665 şablon gurluşlary ulanyldy.Mundan başga-da, “AlphaFold71 MX1”, “UBP18” we “ROBO1” -iň gurluşy hem göz öňünde tutuldy.Belok gurluşy BIOVIA Discovery Studio Visualizer bukjasy (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, ABŞ) we Molekulýar iş gurşawy bukjasy (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreal, Kwebek, Kanada) arkaly şekillendirildi.