ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Himiýa senagatynyň himiki komponenti üçin iki taraplaýyn kebşirlenen turba, SPECC1L ýetmezçiligi bölünen bogunlaryň durnuklylygynyň ýokarlanmagyna we kranial nerw öýjükleriniň dökülmegine sebäp bolýar.

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Çäkli CSS goldawy bilen brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Mundan başga-da, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript-de görkezýäris.

ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Himiýa senagaty üçin goşa kebşirlenen turba

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.poslamaýan polatdan ýasalan turbalar, açyk dykyz turbalar, bökdençsiz örtülen turbalar we ş.m. ýöriteleşen öňdebaryjy öndüriji.Müşderilere ýeňilleşdirmek üçin turbalary we turbalary hem kebşirledik.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.iň ösen önümçilik we synag enjamlary bar.Talabyňyzy doly kanagatlandyryp bileris.Örän berk standartlara görä, biziň öndürýän turbalarymyz elmydama dogry OD we WT çydamlylygyna eýe.Çydamlylyk gözegçiligi standartlary öndürmek üçin berkdir.Önümlerimiz elmydama müşderilerden kanagatlanýar.Müşderiler önümlerimizi satyn aldylar, has köp girdeji gazandylar.
a) OD (Daşarky diametri): 3,18 mm-den 101,6mm
b) WT (Diwaryň galyňlygy): 0,5 mm-den 20mm
ç) Uzynlygy: Müşderiniň islegine görä
d) ülňüler: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 we ş.m.
e) Amal usuly: ERW, EFW we ş.m.

Slaýdda üç makalany görkezýän slaýderler.Slaýdlardan geçmek üçin yzky we indiki düwmeleri ýa-da her slaýddan geçmek üçin ahyrynda slaýd gözegçilik düwmelerini ulanyň.
Düwürtik nerw öýjükleri (CNCC) düwünçejik nerw gatlaklaryndan sypýar we orta aralyk gurluşlarynyň köpüsini emele getirýän faring ýaýlaryna geçýär.CNCC disfunksiýasy, adaty dogabitdi näsazlyk bolan orofasial ýyrtyk etiologiýasynda möhüm rol oýnaýar.Atipiki we sindrom bölekleri bolan näsaglarda geterozigot SPECC1L mutasiýa tapyldy.Bu ýerde, kanoniki ýelimleýji çatryk (AJ) komponentleriniň, β-kateniniň we E-kaderiniň ösen SPECC1L öýjüklerinde güýçlendirilen boýagdygyny habar berýäris we elektron mikrograflar AJ-iň apikal-bazal diffuziýasyny görkezýär.SPECC1L-iň kraniofasial morfogenezdäki roluna düşünmek üçin, Specc1l ýetmezçilikli syçan modelini döretdik.Gomozigoz mutantlar düwünçejik öldüriji bolup, bozulan nerw turbalarynyň ýapylmagyny we CNCC laminasiýasyny görkezýär.Mutant nerw gatlaklarynda AJ belogynyň boýagy köpelýär.Bu AJ kemçiligi, AJ-iň dargamagyny talap edýän CNCC delaminasiýasyndaky kemçilik bilen gabat gelýär.Mundan başga-da, Specc11 mutantlary PI3K-AKT duýduryşyny azaltdy we apoptozy ýokarlandyrdy.In vitro, ýabany görnüşli öýjüklerde PI3K-AKT duýduryşynyň ýumşak päsgelçiligi AJ üýtgemelerine itergi bermek üçin ýeterlikdi.Möhümi, SPECC1L urulmagy netijesinde ýüze çykan AJ üýtgeşmeleri, PI3K-AKT ýolunyň işjeňleşdirilmegi bilen tersine bolup biler.Bu maglumatlar bilelikde alnanda, SPECC1L, PI3K-AKT duýduryş we AJ biologiýasynyň täze sazlaýjysy hökmünde, nerw turbalarynyň ýapylmagy we CNCC gatlaklary üçin zerurdygyny görkezýär.
Kranial nerw krest öýjükleri (CNCCs) deri neýroektodermine lokallaşýar we epitel-mesenhimal geçiş (EMT) 1,2,3 prosesi arkaly ösýän nerw eplençleriniň neýroepitelinden bölünýär.Göçüp barýan epitel CNCC-ler öýjükli birleşmeleri bozýar we birinji we ikinji faring ýaýlaryny doldurýan we kraniofasial kıkyrdagyň köp bölegini emele getirýän mesençimal CNCC-lere öwrülýär.Şeýlelik bilen, CNCC funksiýasyny kadalaşdyrýan genler köplenç diňe ABŞ-da 1/800 dogluşa täsir edýän orofasial ýyrtyklar ýaly kraniofasial dogabitdi anomaliýalaryň etiologiýasynda bozulýar.Dogabitdi deformasiýalaryň biri8.
CNCC-iň delaminasiýasy, syçanlarda düwünçejik ösüşiniň 8.5 bilen 9,5 gün aralygyndaky öňki nerw turbasynyň ýapylmagyna gabat gelýär.Syçanjygyň orofasial ýarylmagy bilen baglanyşykly genleriň mutantlary Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 we Pdgfrα12 ýaly nerw turbalarynyň kemçiligini hem görkezýärler.Şeýle-de bolsa, nerw turbalarynyň ýapylmagy we CNCC gatlaklary garaşsyz hasap edilip bilner, sebäbi Splotch mutant syçanjygy (Pax3) CNCC gatlagyna ýa-da göçmegine hiç hili täsir etmezden nerw turbalarynyň ýapylmagyndaky kemçilikleri görkezýär.CNCC bölünişiginde we nerw turbasynyň ýapylmagynda kemçilikleri bolan goşmaça syçan modelleri, bu iki prosesiň umumy molekulýar esaslaryny kesgitlemäge kömek eder.
CNCC-ni neýroepitel öýjüklerinden izolýasiýa etmek, aktin filamentleri bilen baglanyşykly E-kaderin, β-katenin, α-E-katenin we α-aktinini öz içine alýan belok toplumlaryndan ybarat ýelim çatryklarynyň (AJ) dargamagyny talap edýär. Nerw gatlaklaryndaky E-kaderiniň aşa aşa gysylmagy CNCC delaminasiýasynyň azalandygyny ýa-da gijikdirilendigini görkezdi.Munuň tersine, E-kaderiniň basylmagy irki gatlaklara sebäp bolýar15,16.CNCC gatlaklary wagtynda EMT-ni ara alyp barýan faktorlaryň köpüsi transkripsiýa faktorlarydyr (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) we matrisa metalloproteinazalar (MMPs) ýaly öýjükli öýjükli matrisa (ECM), ýöne CNCC-ler göni sitoskelet AJ sazlaýjylarydyr. entek belli däl.PI3K-AKT ýoly, esasan, rak keselini öwrenmekden E-kaderiniň derejesine garşy çykýar.Soňky gözlegler, syçanlarda PDGFα esasly PI3K-AKT duýduryşynyň ýitmeginiň kraniofasial anormalliklere, şol sanda aýagyň we nerw turbasynyň kemçiliklerine sebäp bolýandygyny görkezdi12.Şeýle-de bolsa, PI3K-AKT ýoly bilen CNCC gatlaklary boýunça AJ durnuklylygynyň arasyndaky baglanyşyk düşnüksiz.
Mundan ozal SPECC1L-i agzyndan gözüňe çenli uzalyp gidýän, obli ýarym (ObFC) ýa-da Tessier IV18 ýarylmagy diýlip atlandyrylýan iki adamda ilkinji mutant gen diýip kesgitledik.SPECC1L mutasiýa, awtosomal agdyklyk edýän Opitz G / BBB sindromy (OMIM # 145410) bolan iki köpmilletli maşgalada ýüze çykaryldy, bu täsir eden adamlarda giperdistansiýa we dodak / dyrnak 19 görkezilýär we Tibi çakdanaşa sindromly bir maşgalada (OMIM # 145420) 20 .Opitz G / BBB sindromynyň ýarysyndan gowragy X bilen baglanyşykly (OMIM # 300000) we mikrotubula bagly öýjük skeletiniň 22 belogyny kodlaýan MID1 genindäki mutasiýa sebäpli ýüze çykýar.SPECC1L, şeýle hem mikrotubulalar we aktin sitoskeletleri bilen baglanyşykly belok, öýjükleriň ýelmeşmegi we göçmegi wagtynda aktin sitoskeletiniň täzelenmegi üçin zerur signallary ara alyp biler diýip çaklaýarys.In vitro we in vivo gözlegleri arkaly, indi SPECC1L-i PI3K-AKT duýduryşy arkaly AJ durnuklylygynyň täze sazlaýjysy hökmünde suratlandyrýarys.Öýjük derejesinde, SPECC1L ýetmezçiligi pan-AKT belogynyň derejesiniň peselmegine we AKT ýolunyň himiki işjeňleşmegi bilen ýok edilen AJ-iň apikal-bazal dispersiýasynyň ýokarlanmagyna sebäp boldy.“Vivo” -de, Specc11 ýetmezçilikli düwünçekler nerw turbalarynyň ýapylmagyny we CNCC bölünişigini peseldýändigini görkezýär.Şeýlelik bilen, SPECC1L ýüz morfogenezi wagtynda kadaly CNCC funksiýasy üçin zerur bolan ýokary derejede kadalaşdyrylan öýjük ýelimleniş signalizasiýasynda işleýär.
Öýjük derejesinde SPECC1L-iň roluny häsiýetlendirmek üçin, SPECC1L18-de öň beýan edilen durnukly osteosarkoma öýjük çyzygy U2OS ulandyk.SPECC1L (kd) urulmagy bilen bu durnukly U2OS öýjükleri, SPECC1L ýazgylarynyň we beloklarynyň derejesinde ortaça (60-70%) peseldi, aktin sitoskeletiniň göçmegi we üýtgedilip gurulmagyndaky kemçilikler bilen birlikde 18. Munuň tersine, wagtlaýyn geçiş peseldi. SPECC1L-iň mitotik kemçiliklere sebäp bolýandygy 23 görkezildi.Has häsiýetlendirilenden soň, durnukly SPECC1L-kd öýjüklerimiziň gaty ýokary derejede morfologiýany üýtgedendigini gördük (1-nji surat).Aýry-aýry ýerlerde aýratyn dolandyryş öýjükleri we kd öýjükleri meňzeşdi (1A surat, D).Birleşenden 24 sagat soň, gözegçilik öýjükleri kuboidal görnüşini sakladylar (1B, E), SPECC1L-kd öýjükleri uzaldyldy (1C surat, F).Öýjük görnüşindäki bu üýtgeşmäniň derejesi gözegçilik öýjüklerini we kd öýjüklerini göni ýaýlymda surata aldy (film 1).SPECC1L-iň birleşýän öýjüklerdäki roluny kesgitlemek üçin ilki bilen onuň aňlatmasyny gözden geçirdik.SPECC1L belok derejesiniň birleşenden soň ýokarlanandygyny gördük (1G surat), SPECC1L transkripsiýa derejesi ýokarlanmady (1H surat).Mundan başga-da, öýjükleriň dykyzlygy ýokarlanansoň, öýjükli araçäklerde ýygnanan SPECC1L belogy (2A-E surat), membrana bilen baglanyşykly β-kateniniň (2A'-E suraty) bir-birine meňzeş nagyş bilen jemlenýär.SPECC1L-iň aktin sitoskeletiniň 18,23 bilen birleşmegini göz öňünde tutup, SPECC1L-iň aktin esasly ýelimleýji birikmeler (AJ) bilen täsirleşýändigini çakladyk.
(AF) SPECC1L urmak (DF) öýjükleri U2OS öýjüklerine (AC) gözegçilik etmek bilen deňeşdirilende ýokary aralykda (F) uzalýar.Bu ýerde dürli öýjük dykyzlygy üçin saýlan alty wagt nokadynyň üçüsi (T1, T3, T6) görkezilýär.(G) Günbatar blot derňewi, SPECC1L belogynyň gözegçilik öýjüklerinde birleşmegiň pes derejesi bilen deňeşdirilende ýokary birleşme derejesinde durnuklaşýandygyny görkezýär.SPECC1L-iň günbatar bölegi garaşylýan 120 kDa zolagy we has ýokary molekulýar agram zolagyny görkezýär, terjime edilenden soň üýtgedilen bolmagy mümkin (*).Günbatar blot derňewi pes we ýokary birleşmek üçin şol bir şertlerde geçirildi.Pes we ýokary aralykda SPECC1L görkezýän suratlar şol bir bölekden alyndy.Şol bir bölek aýryldy we β-aktin antikor bilen gaýtadan gözden geçirildi.(H) Mukdar RT-PCR derňewi SPECC1L transkripsiýa derejesinde düýpli üýtgeşmeleri görkezmedi.Roralňyşlyklar paneli dört sany garaşsyz synagdan SEM-leri görkezýär.
(AE) Öýjük şekliniň derňewini we SPECC1L nokady (kd) bilen U2OS öýjüklerindäki AJ üýtgemelerini kadalaşdyrmak üçin öýjük dykyzlygynyň bir toparyny görkezýän alty wagt nokadyny (T1-T6) saýladyk.Bu wagt nokatlarynyň ilkinji bäşliginde ýeke öýjükler (T1), kiçi öýjük toparlarynyň (T2) 50-70% birleşmegi, kd öýjüklerini (T3) üýtgetmän birleşdirmek, kd öýjüklerini üýtgetmek (T4) we 24 sagat üýtgemeler bar.kd (T5) öýjükleriniň yzky görnüşinde.SPECC1L belogy esasan sitoplazmada T1 (A) -da ýaýrady, ýöne ýygnanmagy indiki wagt nokatlarynda (B - E, oklar) öýjükli serhetlerde hasaba alyndy.(FJ) β-katenin, AJ toplumy bilen baglanyşykly öýjükli serhetlerde şuňa meňzeş ýygnanmany görkezýär... üýtgedi.Barlar = 10 µm.
Soňra SPECC1L ýetmezçiliginiň AJ-e täsirini kesgitlemäge synanyşdyk.AJ bilen baglanyşykly birnäçe markerleri ulandyk, F-aktin, miýozin IIb, β-katenin we E-kaderin 24,25,26,27 kanoniki komponentleri.Aktin stres süýümleri öň beýan edilişi ýaly SPECC1L-kd öýjüklerinde köpeldi (3A, B) 18.Aktin filamentleri bilen baglanyşykly miýozin IIb, vitrodaky SPECC1L-kd öýjükleriniň şuňa meňzeş ýokarlanmagyny görkezdi (3C, D surat).AJ bilen baglanyşykly β-katenin, öýjük membranasyndaky kaderine baglanýar we gözegçilik kubositlerinde adaty “bal ary” aňlatma görnüşini görkezýär (3E, G surat).Gyzykly tarapy, konokok mikroskopiýa ulanylýan tekiz şekillerde, SPECC1L ýetmezçilikli öýjükleriň öýjük membranasyna reňklenen β-katenin (3E, F) we E-kaderin (3G surat, H) uzaldylan boýagyň görnükli nagyşlaryny görkezdi.Kd öýjüklerinde AJ bilen baglanyşykly β-katenin boýagynyň bu giňelmegi, goşulyşanda has aýdyň görünýärdi, ýöne öýjük görnüşiniň üýtgemeginden öň bolup görünýärdi (2F-J, F'-J ').Bu uzaldylan AJ boýagynyň fiziki häsiýetini kesgitlemek üçin, elektron mikroskopiýa (TEM) arkaly SPECC1L-kd U2OS öýjükleriniň apikal-bazal üstündäki öýjük araçäklerini gözden geçirdik (3I surat, J).AJ (oklar) görkezýän aýratyn elektron dykyz sebitleri bolan gözegçilik öýjüklerinden (3-nji surat) tapawutlylykda, kd öýjükleri (3J-nji surat) apikobazal tekizliginde AJ-ny görkezýän ýokary elektron dykyzlygynyň uly, ýakyn sebitlerini görkezdi..Mundan başga-da, transvers bölümlerde β-kateniniň we E-kaderiniň boýag zolaklarynyň giňeldilen görnüşini düşündirýän kd öýjüklerinde (S1A, B) giň öýjük membranasynyň eplenmelerini gördük (3F, H surat).AJ-lerde SPECC1L-iň roluny goldamak üçin β-katenin, U2OS öýjükleriniň lizatlarynda SPECC1L bilen bilelikde immunitet aldy (3-nji surat).AJ markerleri üçin giňeldilen immunizasiýa bilen birlikde, TEM derňewi, SPECC1L ýetmezçiliginiň AJ apical-bazal dykyzlygyny we üýtgeýşini ýokarlandyrýandygy baradaky çaklamamyza laýyk geldi.
(AH) Birleşmeden soňky 48 sagatda kd öýjüklerinde F-aktin boýagynyň ýokarlanmagy (T6; A, B).F-aktin (C, D) bilen baglanyşykly miýozin IIb-iň üýtgedilen boýagy.Dolandyryş öýjüklerinde (E, G) β-katenin we E-kader membranasynyň boýagynyň tekiz nagşy SPECC1L-kd (F, H) öýjüklerinde güýçlendirildi.Barlar = 10 µm.(I - J) Apikal-bazal öýjükli birleşmäni synlaýan elektron mikrograflar.Dolandyryş öýjükleri ýelmeýän çatryklary (I, oklar) görkezýän elektron dykyz sebitleri görkezýär.Munuň tersine, SPECC1L-kd öýjüklerindäki ähli apical-bazal çatryk, dykyzlygyň we ýelimlenýän çatryklaryň ýaýramagyny görkezýän elektron dykyzlygy (J, oklar) peýda boldy.(K) β-katenin, U2OS öýjük lizatlarynda SPECC1L bilen bilelikde immunitet aldy.Dört garaşsyz synagyň birini görkezýän bir ýerden alnan surat.
SPECC1L-iň kraniofasial morfogenezdäki roluna düşünmek üçin, 1-nji introny aňladýan DTM096 we RRH048 (BayGenomics, CA) iki sany garaşsyz ES duzak öýjük setirini ulanyp, Specc1l ýetmezçilikli syçan modelini döretdik (1-nji surat). .4A, S2 surat).Aldaw wektorynyň goýulmagynyň genom ýerleşişi tutuş genom yzygiderliligi bilen kesgitlenildi we PCR tarapyndan tassyklandy (S2-nji surat).Iki gen duzak dizaýny hem, Specc11-lacZ habarçylarynyň tutulandan soň birleşmegine mümkinçilik berdi.Şonuň üçin X-gal boýag bilen kesgitlenen lacZ aňlatmasy Specc11 aňlatmasynyň görkezijisi hökmünde ulanyldy.Iki allel hem meňzeş lacZ aňlatma nagyşlaryny görkezdi, 1-nji bölümdäki DTM096 gen duzagy, 15-nji bölümdäki RRH048-den has güýçli aňlatma görkezdi (görkezilmeýär).Şeýle-de bolsa, Specc1l E8.5 (4B surat) nerw gatlaklarynda, E9.5 we E10.5 (4C surat, D) nerw turbalarynda we ýüz hadysalarynda aýratyn güýçli aňlatma bilen giňden beýan edilýär. E10-da.5 we gözler (4D-nji surat).Öň habar berdik, E10.5-de ilkinji faringial arkadaky SPECC1L aňlatmasy epitelde we CNCC nesiline laýyk gelýän mesenhime18-de bar.CNCC-de SPECC1L aňlatmasyny barlamak üçin E8.5 nerw eplenmelerini (4E-J surat) we E9.5 kellesi bölümlerini ýerine ýetirdik (4K- surat).E8.5-de, SPECC1L NCC markerleri bilen reňklenen öýjükleri goşmak bilen (4E, H) nerw eplenmelerini güýçli reňkledi (4G, J).E9.5-de, SPECC1L (4K surat, N) AP2A (4L surat, M) ýa-da SOX10 (4O surat, P) bilen bilelikde reňklenen göçüp barýan CNCC güýçli reňkli.
(A) ES DTM096 (intron 1) we RRH048 (intron 15) öýjük klonlarynda aldaw wektorynyň goýulmagyny görkezýän Specc11 geniniň shematiki görnüşi.(BD) E8.5-den E10.5-e çenli Specc1l aňlatmasyny görkezýän heterozigotly Specc1lDTM096 düwünçekleriniň lakZ boýagy.NE = neýroektoderm, NF = nerw gatlagy, PA1 = ilkinji faringeal arka..SPECC1L boýagy, AP2A (F, G; ok kelleleri) we SOX10 (I, J; ok kelleleri) bilen belgilenen öýjükleri goşmak bilen E8.5 (E, H; ok kelleleri) nerw gatlaklarynda giňden syn edildi.E9.5-de, SPECC1L AP2A (L, M; oklar) we SOX10 (O, P; oklar) bellikli göçüp barýan CNCC-leri (K, N; oklar) güýçli reňkledi.
Geterozigotly Specc1lDTM096 / + we Specc1lRRH048 / + syçanlaryň arasyndaky kesiş, iki gen duzak aleliniň biri-biriniň üstüni ýetirmeýändigini we gen duzagy allelleri üçin birleşýän heterozigotlaryň we düwünçejik gomozigotlaryň düwünçejik öldüriji bolandygyny görkezýär (S1 Tablisa).Mendelian gatnaşygy, dogulanda heterozigotlaryň diri galma derejesiniň peselendigini görkezýär (garaşylýan 1.34 vs 2.0).Geterozigotlaryň arasynda pes perinatal ölümiň bardygyny belledik, käbirleriniň kraniofasial anomaliýalary bar (S3-nji surat).Şeýle-de bolsa, bu perinatal kraniofasial fenotipleriň pes aralaşmagy, olaryň esasy patofiziologiki mehanizmlerini öwrenmegi kynlaşdyrýar.Şol sebäpden, gomozigoz Specc11 mutantlarynyň düwünçejik öldüriji fenotipine ünsi jemledik.
Birleşýän heterozigoz ýa-da birmeňzeş Specc1lDTM096 / RRH048 mutant düwünçekler E9.5–10.5 (5A - D suratlar) soň ösmedi we nerw turbasy öň ýapylmady (5B, D suratlar) we käwagt yzky görnüşde ýapylýar (görkezilmeýär). ..Bu kranial nerw turbasynyň ýapylmagy kemçiligi, CN10 belgili DLX2 bilen nerw gatlaklarynda galan EX.5 belgisi bilen baglanyşyklydy, hiç hili bölünişigi görkezmedi (5A'-D 'surat).CNCC-iň umumy ululygynyň hem azalandygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, CNC çyzyklaryny GFP bilen Wnt1-Cre we ROSAmTmG bilen gen duzak setirlerimizde belledik.GFP + NCC we GFP- (RFP +) NCC däl düwünçeklerden tertipleşdirýäris.E9.5-de, adaty CNCC spesifikasiýasyny görkezýän, WT we mutant düwünçekleriň arasynda akym görnüşli GFP belgili CNCC-leriň paýy düýpgöter üýtgemedi.Şol sebäpden, açyk nerw gatlaklarynda galyndy Wnt1-Cre we DLX2 boýag (5B surat), CNCC gatlagynyň kemçilikli bolmagy, SPECC1L-kd öýjüklerinde görkezilişi ýaly AJ öýjükleriniň dykyzlygynyň ýokarlanmagy ýa-da ýaýramagy bilen baglanyşyklydyr diýip çakladyk.Nerw nerwinde CNCC-iň bardygyny tassyklamak üçin NCC markerlerini SOX10, AP2A we DLX2 ulandyk (5E-R surat).E8.5-de, WT (5E, G, I) we Specc1l mutant (5F, H, J) bölümlerinde üç sany NCC markeriniň hemmesi üçin nerw gatlagy boýaldy.E9.5-de, NCC markerleri WT bölümlerinde göçýän NCC tegmilleri (5M, O, Q) reňklenen bolsa, Specc1l mutant düwünçekleriniň açyk nerw gatlaklarynda galyndy NCC boýagy hasaba alyndy (5N, P, R).SOX10 we DLX2 göçüp barýan CNCC-leri bellänligi sebäpli, bu netije SPECC1L ýetmezçilikli CNCC-leriň göçüp-gonandan soňky spesifikasiýany gazanýandygyny, ýöne nerw gatlaklaryndan göçüp bilmeýändigini görkezýär.
Specc11 ýetmezçiligi nerw turbalarynyň kemçiliklerine, kranial nerw öýjükleriniň we AJ-leriň delaminasiýasyna getirýär.
(A, B ') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') bilen bellikli göçüp barýan kranial nerw öýjüklerini (CNCC) göterýän düwünçejik.Munuň tersine, Specc11 mutant düwünçekleri açyk nerw bukjalaryny (B), ok kellelerini we göçmedik CNCC-leri görkezýär (B ', oklar)..WT E10. oklar).) CNCC-iň pes delaminasiýasyny we göçmegini görkezýän käbir boýaglar (oklar) bilen.ER) E8.5 (E - L) we E9.5 (M - R) tapgyrlarynda WT we Specc1l mutant düwünçekleriniň bölümleri NCC markerleri SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) we DLX2 (I, J, Q, R).E8.5-de ýabany görnüşli nerw gatlagynda (NF) we mutant bölümlerinde NCC boýagy göründi.SOX10 we β-kateniniň E8.5 WT (K) we mutant (L) bilen bilelikde boýalmagy, nerw gatlaklarynda öýjük araçäklerinde β-kateniniň köpelmegini ýüze çykardy.E9.5-de göçüp barýan CNCC-leriň (M, O, Q) ýabany görnüşli boýaglary, mutantlarda bolsa, kesgitlenmedik CNCC-ler açyk nerw gatlaklaryny (N, P, R) gördi.(S - Z) E9.5 mutasiýa bilen WT we Specc11DTM096 / RRH048 düwünçegiň koronal bölümlerinde vivo AJ bellik derňewi.Rightokarky sag burçda takmynan bölüm tekizligi görkezilýär.Mutant dokumalarynyň bölümlerinde F-aktin (S, T) we miýozin IIb (U, V) köpelmegi ýüze çykdy.3-nji suratdaky in vitro netijelerine meňzeş, mutant düwünçeklerde β-katenin (W, X) we E-kaderin (Y, Z) üçin güýçlendirilen membrananyň boýagy hasaba alyndy..Munuň tersine, Specc11 mutant düwünçekleriniň (BB, oklar) bölümlerinde tutuş apikobazal çatryk elektron dykyzlygy bolup, ýelimlenýän çatryklaryň dykyzlygynyň we ýaýramagyny görkezýär.
Gatnaşygyň peselmeginiň üýtgedilen AJ sebäpli ýüze çykýandygy baradaky çaklamamyzy barlamak üçin, Specc1l mutant düwünçekleriniň açyk nerw gatlaklarynda AJ belgilemesini gözden geçirdik (5S-Z surat).Aktin stres süýümleriniň köpelendigini (5S, T) we aktin süýümlerinde boýag miýozin IIB-iň lokalizasiýasynyň ýokarlanandygyny gördük (5U, V surat).Möhüm zat, öýjükli serhetlerde β-kateniniň (5W, X surat) we E-kaderiniň (5-nji surat, Z) köpelmegini gördük.Şeýle hem, E8.5 düwünçekleriniň nerw gatlaklarynda NCC β-kateniniň reňkini gözden geçirdik (5K, L surat).AJ üýtgeşmeleriniň başlandygyny görkezýän Specc1l mutant nerw gatlaklarynda (5L we K surat) cat-katenin boýagy has güýçli bolup göründi.E9.5 düwünçekleriniň kelle bölekleriniň elektron mikrograflarynda, WT (5AA, BB we S1E-H) bilen deňeşdirilende Specc1l mutant düwünçeklerinde ýaýran elektron dykyz boýaglaryň ýene-de bir gezek bolandygyny gördük.Bu netijeler bilelikde alynsa, SPECC1L-kd U2OS öýjüklerindäki in vitro netijelerimizi goldaýar we mutant düwünçeklerimizde AJ reňkiniň CNCC gatlagyndan öňdigini görkezýär.
AKT işjeňligi bilen E-kaderiniň durnuklylygynyň arasyndaky belli garşylykly gatnaşygy göz öňünde tutup, 17,28 PI3K-AKT duýduryşynyň gatnaşygyny çakladyk.Mundan başga-da, E9.5-10.5-de ölümden (<5%) gaçyp, ýerine E13.5 töwereginde mesgen tutan käbir mutant düwünçeklerimizde subepidermal güllemegi gördük (S3-nji surat).Subepidermal wezikullar, PDGFRα12 esasynda azalýan PI3K-AKT duýduryşynyň alamaty.Fantauzzo we başgalar.(2014) PdgfraPI3K / PI3K mutant düwünçeklerinde PDGFRα esasly PI3K işjeňleşmesiniň bozulmagynyň subepidermal wezikulalara, nerw turbalarynyň kemçiliklerine we aýak dodaklarynyň fenotiplerine sebäp bolýandygy habar berildi.Hakykatdanam, pan-AKT we işjeň fosforirlenen Ser473-AKT derejeleri Specc1l mutant dokumalarynda wivo görnüşinde E9.5 düwünçejik tussag edilmegine çenli azaldy (6A-D surat).Fosforirlenen Ser473-AKT derejesiniň peselmegi, pan-AKT derejesiniň wivo (FIG. 6E) we in vitro (FIG. 6F) peselmegi bilen baglanyşykly bolup biler.Witro peselmegi diňe U2OS öýjükleriniň öýjük görnüşiniň üýtgemegi we AJ dykyzlygy bilen güýçli gabat gelende ýüze çykdy (6D-nji surat).Şeýlelik bilen, maglumatlarymyz SPECC1L-iň kraniofasial morfogenezde signal berýän PI3K-AKT täze pozitiw sazlaýjydygyny görkezýär.
. , WT gözegçilik bilen deňeşdirilende.Günbatar partlamalary şol bir şertlerde ýabany görnüşli lizatlarda we mutant lizatlarda geçirildi.SPECC1L üçin görkezilen suratlar bir bölekden alyndy.Şol bir bölek aýryldy we anti-pan-ACT we β-aktin antikorlary bilen gaýtadan gözden geçirildi.E8.5 nerw gatlaklarynda (A, B) Pan-AKT derejesi we E9.5 kellesi bölümlerinde fosforirlenen S473-AKT derejesi ep-esli azaldy.(F) Pan-AKT derejesi ýokary birleşmede ýygnan SPECC1L-kd U2OS öýjükleriniň lizatlarynda hem peseldi.Roralňyşlyklar paneli, üç sany günbatar günbatar mukdaryndan SEM-leri görkezýär.(GJ) WT düwünçekleriniň E9.5 bölümleri, degişlilikde KI67 we ýapylan kaspaz 3, öýjükleriň köpelmegini (G, G ') we az apoptotik işjeňligi görkezýär (H, H').Specc11 mutant düwünçekleri deňeşdirip boljak öýjükleriň köpelmegini görkezýär (I), ýöne apoptoz keselinden geçýän öýjükleriň sany ep-esli artýar (J).
Soňra köpelmegiň we apoptozyň belliklerini gözden geçirdik.WT mutantlary üçin 82,5%, KI67 boýag bilen ölçenen Specc1l mutantlary üçin 89.5% E9.5 düwünçekleriň (I bilen deňeşdirilende 6E, G) köpelmeginde hiç hili tapawudy görmedik (p <0.56, Fisher's) takyk synag).Edil şonuň ýaly-da, düwünçejik tutulýança (görkezilmeýär) (görkezilmeýär) E8.5-de nerw gatlaklarynda ýapylan kaspaz 3 üçin reňk bilen ölçenen apoptozda hiç hili tapawudy görmedik.Munuň tersine, ähli E9.5 mutant düwünçeklerinde apoptoz ep-esli ýokarlandy (6F, H we J).Apoptozyň bu umumy ýokarlanmagy PI3K-AKT duýduryşynyň peselmegi we düwünçejik ölüminiň 29,30,31 bilen gabat gelýär.
Ondan soň, kd öýjüklerimizdäki AJ üýtgemelerinde PI3K-AKT duýduryşynyň sebäp roluny tassyklamak üçin gözegçilik we kd öýjüklerindäki ýoly himiki taýdan üýtgetdik (7A-F surat).Iň uzyn ölçegiň (uzynlygyň) degişli dik ölçege (ini) gatnaşygyny ulanyp kesgitlän SPECC1L-kd öýjüklerinde syn edilýän öýjük şekiliniň üýtgemeginiň fenotipini bellik hökmünde ulanýardyk.Deňdir tegelek ýa-da kuboidal öýjükler üçin 1 gatnaşygy garaşylýar (7G surat).Öýjük şekiline goşmaça, AJ-e täsirini β-kateniniň boýagy bilen tassykladyk (7A'-F ').Wortmanniniň kömegi bilen PI3K-AKT ýolunyň gadagan edilmegi dolandyryş öýjüklerinde (7A surat, C) we AJ (7A surat) öýjük şekilini üýtgetmek üçin ýeterlikdi.PI3K-AKT işjeňleşdiriji SC-79, gözegçilik öýjüklerinde öýjük şekiline (FIG. 7A, E) ýa-da AJ giňelmegine (FIG. 7A ') täsir etmedi.SPECC1L-kd öýjüklerinde PI3K-AKT ýolunyň mundan beýläk-de basylmagy apoptozyň köpelmegine (7B, D) we wivo agyr mutantlarymyza laýyk gelýän β-katenin boýagynyň ep-esli ýokarlanmagyna getirdi (7B surat).Möhümi, PI3K-AKT ýolunyň işjeňleşdirilmegi öýjük görnüşini ep-esli gowulaşdyrdy (7B, F) we AJ fenotipleri (7B surat).Öýjük görnüşiniň üýtgemegi öýjükleriň tegelek gatnaşygy (CCR) hökmünde kesgitlenildi we ýokarda görkezilişi ýaly ähmiýet bilen deňeşdirildi (FIG. 7G).Hakykatdanam, gözegçilik öýjüklerinde (7G-nji surat, CCR = 1.56), wortmanniniň bejergisi öýjügiň görnüşini ep-esli üýtgetmek üçin ýeterlikdi (7G-nji surat, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9). SPECC1L-de.-kd öýjükleri (7G-nji surat, CCR = 3.46).SPECC1L-kd öýjükleriniň Wortmannin bejergisi (7G surat, CCR = 3.60, ähmiýetsiz) bejerilmedik kd öýjüklerinden (7G surat, CCR = 3.46, ähmiýetsiz) ýa-da wortmannin bilen bejerilen gözegçilik öýjüklerinden has möhüm däldi (7G surat)., CCR = 3.46, ähmiýetsiz) goşmaça öýjükleriň uzalmagyna täsir edýär (7G, CCR = 3.61, ähmiýetsiz).Iň esasy zat, SC-79 AKT işjeňleşdirijisi, SPECC1L-kd öýjükleriniň uzyn fenotipini dikeltdi (7G-nji surat, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Bu netijeler, SPECC1L-iň PI3K-AKT signalyny kadalaşdyrýandygyny tassyklaýar we SPECC1L-iň ortaça peselmeginiň öýjükleriň ýelmeşmegine täsir edýändigini görkezýär, güýçli peselme bolsa apoptoza sebäp bolýar (8-nji surat).
(A - F ') Dolandyryş (A, C, E) we SPECC1L-kd (B, D, F) öýjükleri PI3K-AKT ýol inhibitory wortmannin (C, D) ýa-da SC-79 işjeňleşdiriji (E, F) bejergisi bilen bejerilýär Bejerilmedik gözegçilik öýjükleri adaty β-pişik öýjükli boýag (A ') bilen kuboidal (A), kd öýjükleri bolsa (B) β-pişigiň boýagy (B') bilen uzalýar.PI3K-AKT ýoly basylandan soň, gözegçilik öýjükleri (C) β-pişigiň giňelmegi (C ') bilen uzaldyldy, kd öýjükleri bolsa ýokary üýtgän düwünçeklerimize meňzeş we aşa ösen β-pişigi görkezýän apoptoz (D) geçip başlady.boýag (D ').PI3K-AKT ýoly işjeňleşdirilenden soň, gözegçilik öýjükleri kuboidal (E) bolup galdy we adaty β-pişik (E ') boýagy bardy, kd öýjükleri bolsa öýjük şeklini (F) we β-pişik (F') reňkini ep-esli gowulandyrdy. (G) Öýjük şekiliniň üýtgemeginiň derejesi iň uzyn ölçegdäki (uzynlyk) we degişli dikligine (ini) MetaMorph programma üpjünçiligini ulanyp, öýjükleriň tegelek gatnaşygy (CCR) ulanylyp kesgitlenildi.Bejerilmedik (NT) SPECC1L-kd öýjükleri (CCR = 3.46) gözegçilik öýjüklerinden ep-esli uzyn (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).Wortyň PI3K-AKT ýoluny dolandyryş öýjüklerinde saklamagy, öýjük görnüşindäki şuňa meňzeş uzalma sebäp boldy (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Şonuň ýaly-da, SPECC1L-kd öýjüklerinde SC-79 tarapyndan AKT işjeňleşdirilmegi, gözegçilik derejelerine gözegçilik etmek üçin öýjükleriň uzalmagyny dikeltdi (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).SPECC1L-kd öýjüklerini Wortmannin bejermek, apoptozyň köpelmegine sebäp boldy, ýöne gözegçilik edilmedik kd (CCR = 3.46, ns) ýa-da wortmannin bilen bejerilen gözegçilik öýjükleri (3.61) bilen deňeşdirilende öýjük şekiliniň üýtgemegi (CCR = 3.60) ýokarlanmady.ns = tapawudy ýok.+/- 50 öýjük üçin SEM ölçegleri görkezilýär.Statistik tapawutlar Talyp synagyndan peýdalanyp hasaplandy.
(A) PI3K-AKT ýolunyň inhibisiýasynyň we işjeňleşmeginiň shematiki şekillendirilmegi, degişlilikde AJ üýtgemegine we halas edilmegine getirýär.(B) SPECC1L tarapyndan AKT belogyny durnuklaşdyrmak üçin teklip edilen model.
Öňünden gelýän CNCC-ler, öňki nerw gatlagynyň neýroepiteli öýjüklerinden aýrylmagy üçin AJ lizisini talap edýär1,15,32.AJ komponentleriniň boýagynyň ýokarlanmagy we in vitro hem-de wivo görnüşinde SPECC1L ýetmezçilikli öýjüklerde apical-bazal AJ asimmetrik paýlanyşynyň ýitmegi, SPECC1L β-katenine fiziki ýakynlygy bilen bilelikde, SPECC1L-iň AJ ýerli durnuklylygyny dogry saklamak üçin işleýändigini görkezýär; gurama myşsalary.aktin sitoskeleti.SPECC1L-iň aktin sitoskeleti we β-katenin bilen birleşmegi we SPECC1L ýok mahaly kondensirlenen aktin filamentleriniň sanynyň köpelmegi AJ dykyzlygynyň ýokarlanmagyna laýyk gelýär.Anotherene bir ähtimallyk, SPECC1L ýetmezçilikli öýjüklerde aktin süýümleriniň köpelmegi öýjükli dartgynlylygyň üýtgemegine sebäp bolup biler.Öýjükli stres AJ 33 dinamikasyna täsir edýändigi sebäpli naprýa .eniýeniň üýtgemegi AJ 34-iň has ýaýramagyna sebäp bolup biler.Şonuň üçin islendik üýtgeşmeler CNCC gatlaklaryna täsir eder.
Wnt1, nerw öýjükleriniň döremegine sebäp bolýan irki nerw gatlaklarynda aňladylýar.Şeýlelik bilen, Wnt1-cre nesil yzarlaýyş NCC35-den öň we göçýän belgileri görkezýär.Şeýle-de bolsa, Wnt1 beýniniň dokumalarynyň klonlaryny hem belleýär, irki nerw gatlaklaryndan alnan 35,36, bu açyk nerw bukjalarynda Wnt1 markerleri üçin E9.5 mutantlaryň boýagynyň CNCC däldigi ähtimal.NCC markerleri AP2A we SOX10 üçin polo positiveitel boýagymyz, Specc11 mutant düwünçekleriniň açyk nerw gatlaklarynda hakykatdanam CNCC bardygyny tassyklady.Mundan başga-da, AP2A we SOX10 irki göçüp barýan NCC-iň alamatlary bolany üçin, polo positiveitel boýag bu öýjükleriň göçürişden soňky CNCC bolandygyny, E9.5 bilen bölünip bilinmeýändigini görkezýär.
Maglumatlarymyz, AJ-ni SPECC1L tarapyndan molekulýar kadalaşdyrmagyň PI3K-AKT signalizasiýasy bilen araçylyk edýändigini görkezýär.AKT duýduryşy SPECC1L ýetmezçilikli öýjüklerde we dokumalarda azalýar.Fantauzzo we ş.Kraniofasial morfogenezde PI3K-AKT signalizasiýasy üçin gönüden-göni roly goldaň.(2014) PDGFRα esasly PI3K-AKT duýduryşynyň işjeňleşdirilmezliginiň aýak aýagynyň fenotipine sebäp bolýandygyny görkezdi.Şeýle hem, PI3K-AKT ýolunyň gadagan edilmeginiň AJ we U2OS öýjüklerindäki öýjük görnüşini üýtgetmek üçin ýeterlikdigini görkezýäris.Gözleglerimiz bilen yzygiderli, Keýn we başgalar.37, endotel öýjüklerinde PI3K α110 subunitiniň peselmeginiň, “birikdiriş indeksiniň” ýokarlanmagy diýlip atlandyrylýan perisellüler β-katenin boýagynyň şuňa meňzeş ýokarlanmagyna sebäp bolandygyny görkezdi.Şeýle-de bolsa, aktin filamentleri eýýäm ýokary derejede gurnalan endotel öýjüklerinde, PI3K-AKT ýolunyň basylmagy gowşak öýjük şekiline getirýär.Munuň tersine, SPECC1L-kd U2OS öýjükleri uzyn öýjük görnüşini görkezdi.Bu tapawut öýjük görnüşine mahsus bolup biler.PI3K-AKT duýduryşynyň basylmagy aktin sitoskeletine hemişelik täsir etse-de, öýjük şekiline täsiri merkezi aktin süýümleriniň dykyzlygynyň we guralyşynyň üýtgemegi sebäpli ýüze çykýan dartgynlylygyň üýtgemegi bilen kesgitlenýär.U2OS öýjüklerinde, diňe SPECC1L ýetmezçilikli AJ üýtgemeginiň we dikeldişiniň nyşany hökmünde öýjük görnüşiniň üýtgemelerini ulandyk.Sözümiziň ahyrynda, SPECC1L ýetmezçiliginde AKT ýolunyň gadagan edilmegi AJ durnuklylygyny ýokarlandyrýar we CNCC-de delaminasiýany azaldýar diýip çaklaýarys.
Gyzykly tarapy, SPECC1L ýok mahaly fosforirlenen 473-AKT derejesinden başga-da, pan-AKT derejesi peseldi, bu bolsa AKT belogynyň durnuklylygy ýa-da dolanyşygy derejesinde PI3K-AKT duýduryşyny kadalaşdyrmagy teklip edýär.Opitz / GBBB sindromy bilen baglanyşykly SPECC1L we MID1 genleri, 18,22 mikrotubulary durnuklaşdyrýan beloklary kodlaýar.SPECC1L we MID1 araçy mikrotubulary durnuklaşdyrmagyň mehanizmine doly düşünilmeýär.SPECC1L ýagdaýynda, bu durnuklaşdyrma 18 mikrotubulalaryň bir böleginiň güýçlendirilen asetilizasiýasyny öz içine alýar.SPECC1L-iň AKT ýaly beýleki beloklary durnuklaşdyrmak üçin şuňa meňzeş mehanizm ulanmagy ähtimal.AKT belogynda lizin galyndylarynyň asetilizasiýasynyň membrananyň lokalizasiýasynyň we fosforilasiýanyň peselmegine sebäp bolýandygy görkezildi38.Mundan başga-da, membrananyň lokalizasiýasy we işjeňleşdirilmegi üçin AKT-de şol bir lizin galyndysynda K63 zynjyrynyň hemme ýerde ulanylmagy zerurdyr.Dürli ýokary geçişli hamyrmaýa iki gibrid ekranda ýüze çykarylan SPECC1L beloklary bilen täsirleşýän birnäçe faktorlaryň arasynda dört - CCDC841, ECM2942, APC we UBE2I43 - hemme ýerde ýa-da jemleýiş arkaly belok dolanyşygyna ýa-da durnuklylygyna degişlidir.SPECC1L, AKT durnuklylygyna täsir edip, AKT lizin galyndylarynyň terjimeden soňky üýtgemegine gatnaşyp biler.Şeýle-de bolsa, AKT belogynyň lokalizasiýasynda we durnuklylygynda SPECC1L-iň möhüm roly entek düşündirilmeli.
“Vivo” -de SPECC1L aňlatmasyndaky düýpli kemçilikler, AJ markeriniň reňklenmegine we CNCC örtüginiň kemçiligine, apoptozyň we düwünçegiň irki ölümine sebäp boldy.Öňki habarlarda apoptoz derejesiniň ýokarlanmagy bilen syçan mutantlarynyň 44,45,46,47 nerw turbalarynyň kemçilikleri we kraniofasial kemçilikler bilen baglanyşyklydygy görkezildi48.Nerw gatlaklarynda ýa-da faringial ýaýlarda öýjükleriň aşa köp ölmegi, morfogenetiki hereket üçin zerur bolan öýjükleriň sanynyň 48,49,50 bolup biljekdigine öňe sürüldi.Munuň tersine, ortaça peseldilen SPECC1L aňlatmasy bolan SPECC1L ýetmezçilikli öýjük çyzyklarymyz, öýjük ölüminiň ýokarlanandygyny subut etmezden diňe AJ üýtgemelerini görkezdi.Şeýle-de bolsa, bu Kd öýjüklerinde PI3K-AKT ýolunyň himiki taýdan gadagan edilmegi apoptozyň ýokarlanmagyna sebäp boldy.Şeýlelik bilen, SPECC1L aňlatmanyň ýa-da funksiýanyň ortaça peselmegi öýjükleriň ýaşamagyny üpjün edýär.Bu, seýrek ýagdaýda Specc11 mutant düwünçekleriniň köçede tussag edilmeginden gaçýandygy baradaky syn bilen gabat gelýär.E9.5, belki-de gen almagyň netijeliliginiň peselmegi sebäpli, nerw turbalaryny ýapyp, ösüşinde köplenç kraniofasial kemçilikler bilen durup bilýär (S3-nji surat).Mundan başga-da, kraniofasial anormallikler bilen heterozigotly Specc1l düwünçekleriniň seýrek ýüze çykmagy, belki-de gen almagyň netijeliliginiň ýokarlanmagy bilen baglanyşyklydyr, şeýle hem iki SPECC1L ortologynyň (specc1lb) giçki düwünçejik fenotipleriniň ýitmegine sebäp bolýan zebrafiş tapylmagydyr. aşaky eňekler we ikitaraplaýyn ýyrtyklar51.Şeýlelik bilen, adam hassalarynda ýüze çykarylan heterozigoz SPECC1L funksiýasynyň ýitmegi, kraniofasial morfogenez döwründe SPECC1L funksiýasynyň ownuk bozulmalaryna sebäp bolup biler, bu olaryň orofasial ýyrtyklaryny düşündirmek üçin ýeterlikdir.Öýjükli aragatnaşyklary SPECC1L esasly kadalaşdyrmak, palatogenezde we faringial ýaýlaryň birleşmeginde hem rol oýnap biler.SPECC1L funksiýasynyň mundan beýläkki gözlegleri, neýroepiteli öýjük hereketinde we kraniofasial morfogenezde nerw turbalarynyň ýapylmagy wagtynda CNCC-de wagtlaýyn öýjükli aragatnaşyklaryň roluny düşündirmäge kömek eder.
U2OS osteosarkoma gözegçilik we SPECC1L-kd öýjükleri öň beýan edilipdi (Saadi we başg., 2011).SPECC1L-e garşy antikorlar öňem häsiýetlendirilipdi (Saadi we başg., 2011).Anti-katenin antikorlary (towşan; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (syçan; 1: 1000; Öýjük signalizasiýa tehnologiýasy, Danwerler, MA), miýozin IIb (1: 1000; Sigma-Aldriç, Sent-Luis ), MO)), E-kaderin (1: 1000; Abkam, Kembrij, MA), AP2A (1: 1000; Nowus biologiýasy, Littleton, Kolos.), SOX10 (1: 1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego) , Kaliforniýa), DLX2 (1: 1000; Abcam, Kembrij, MA), fosho-Ser473-AKT (1: 1000; Öýjük signalizasiýa tehnologiýasy, Danwerler, MA), pan-AKT (1: 1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ). MO) beýan edilişi ýaly ulanyldy..Aktin filamentleri Acti-tegmilli rodamin phaloidin (Sitoskeleton, Denwer, Kolorado) bilen boýaldy.
U2OS gözegçilik öýjükleri we SPECC1L-kd öýjükleri 10% düwünçegiň irinli (Life Technologies, Carlsbad, CA) bilen doldurylan adaty ýokary glýukoza DMEM-de ösdürilip ýetişdirildi.AJ üýtgeşmeleri üçin 0,1% porzin jelatin (Sigma-Aldriç, Sent-Luis, MO) bilen bejerilen aýna 2 x 105 öýjük sepildi we öýjük görnüşiniň üýtgemegine gözegçilik edildi.Öýjükler dürli görkezilen wagt nokatlarynda ýygnaldy: ekişden 4 sagat soň (t = 1), ekişden 24 sagat soň (t = 2), öýjük görnüşiniň üýtgemezden birleşmegi (t = 3), öýjük görnüşiniň üýtgemegi (t = 4) , Öýjük görnüşiniň üýtgemeginden 24 sagat (t = 5) we öýjük görnüşiniň üýtgemeginden 48 sagat soň (t = 6) (1, 2, 3-nji surat).PI3K-AKT ýoluny modulirlemek üçin öýjükler görkezilen konsentrasiýalarda PI3K-AKT inhibitory wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ýa-da SC-79 işjeňleşdiriji (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) bilen ösdürilip ýetişdirildi.Himiki maddalary öz içine alýan serişde her gün çalşylýar.
Çarçuwaly ýazgylar adaty medeniýet şertlerinde göni gözegçilikde we KD öýjüklerinde geçirildi we faza kontrast şekilleri her 10 minutdan 7 günüň dowamynda ýygnaldy.Suratlar, mehaniki basgançak bilen enjamlaşdyrylan we QImaging Retiga-SRV kamerasyna birikdirilen 10 × N-PLAN maksatly kompýuter bilen dolandyrylýan Leica DM IRB ters mikroskopyň kömegi bilen alyndy.Surata düşürilende, 5% CO2 bilen çygly atmosferada öýjük medeniýeti 37 ° C derejesinde saklandy.
Sebit Mutant Syçan Resurs Merkezinden (UC Davis, CA) iki sany gen duzagy ES öýjük liniýalary, Specc1lgtDTM096 we Specc1lgtRRH046 kesgitlenen Specc11 ýetmezçilikli syçanjyk çyzyklaryny döretmek üçin ulanyldy.Gysgaça, C57BL6 blastositlerine 129 / REJ ES öýjükleri sanjym edildi.Alnan himiki erkek syçanlar, agouti palto reňkli nesilleri kesgitlemek üçin aýal C57BL6 syçanlar bilen ösdürilip ýetişdirildi.Geterozigotlary kesgitlemek üçin gen duzagy wektor goýmalarynyň bolmagy ulanyldy.Syçanlar 129 / REJ; C57BL6 garyşyk fonda saklandy.Genetiki duzak wektorynyň goýulýan ýeriniň ýerleşişi RT-PCR, genleriň yzygiderliligi we genetiki goşundy bilen tassyklandy (Goşmaça 1-nji surat).Iki sany heterozigotly Specc1lGT syçanlaryň CNCC nesil yzarlamak üçin, ROSAmTmG (# 007576) we Wnt1-Cre (# 003829) syçanlar (Jekson barlaghanasy, Bar Harbour, ME) Specc1l mutant düwünçeklerinde ROSAmTmG we Wnt1-Cre allelini öndürmek üçin kesildi.Syçanlardaky ähli synaglar Kanzas uniwersitetiniň lukmançylyk merkeziniň haýwanlara ideg we edara ediş instituty tarapyndan tassyklanan teswirnamalara laýyklykda geçirildi.
Düwürtikler (1% formaldegid, 0,2% glutaraldegid, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) otag temperaturasynda 60 minutda berkitildi.X-gal boýag ergininde kesgitlenenden soň (5 m kaliý ferriýanid, 5 m kaliý ferrosýanid, 2 mM MgCl2, 0,01% natriý deoksiholat, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Dokanyň ösüşi 37 ° C-de geçirildi. .1-6 sagadyň içinde ° C.Düwürtikler 4% PFA-da post-düzüldi we wizuallaşdyryldy.
Günbatar partlamalary üçin öýjükler HALT proteaz ingibitorlarynyň (Sigma-Aldriç, Sent-Luis, MO) garyndysy bilen doldurylan passiw liz buferinde (Promega, Fitchburg, WI) lizirlendi.Lizatlar 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX taýýar jellerde (Bio-Rad, Gerkules, CA) gaýtadan işlenip, Immobilon PVDF membranalaryna geçirildi (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranalar 0,1% Tween bolan PBS-de 5% süýtde petiklendi.Antikorlar bir gije 4 ° C ýa-da otag temperaturasynda bir sagatlap inkubasiýa edildi.Signal döretmek üçin Femto SuperSignal West ECL reagenti (Termo Scientific, Waltham, MA) ulanyldy.Immunizasiýa etmek üçin düwünçekler bir gijede 4% PFA / PBS-de düzüldi we kriopreswirlenen.Dokum kriozeksiýalary 1% adaty geçi serumu (Termo Scientific, Waltham, MA) we 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldriç, Sent-Luis, MO) öz içine alýan PBS-de bloklandy we soňra 4 ° C inkubatorda inkubasiýa edildi. gije.antikor we floresan ikinji derejeli antikor bilen (1: 1000) 4 ° C-de 1 sagatlap.Boýalan bölümler ProLong altyn gurşawyna (Termo Scientific, Waltham MA) ýerleşdirildi we Leica TCS SPE konokok mikroskopy arkaly tekiz suratlar alyndy.Her bir immunizasiýa, azyndan iki mutant düwünçegiň kesilmegi boýunça üç sany garaşsyz synag hökmünde geçirildi.Wekilçilikli synag görkezilýär.
Öýjükler üýtgedilen RIPA buferinde (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 m EDTA we HALT proteaz inhibitory (Sigma-Aldriç, Sent-Luis, MO) inkubasiýa edildi. Gysgaça aýdanyňda, lizatlar G magnitli monjuklar (Life Technologies, Carlsbad, CA) bilen öňünden taýýarlanyldy we SPECC1L çykarmak üçin SPECC1L ýa-da IgG belogy G belok monjuklary bilen bir gije 4 ° C inkubasiýa edildi we anti-ulanmak arkaly Günbatar blotirlendi. aboveokarda beýan edilen -β-katenin antikorlary, görkezilen IP synaglary dört sany garaşsyz synagyň wekili.
Kanzas uniwersitetiniň lukmançylyk merkezindäki elektron mikroskopiýa merkezine durnukly medeniýetli öýjükler ýa-da syçanjygyň düwünçejik dokumalary berildi.Gysgaça, nusgalar EMbed 812 rezine (Elektron mikroskopiýa ylymlary, Fort Waşington, PA) ýerleşdirildi, bir gije 60 ° C-de polimerizasiýa edildi we göwher pyçak bilen enjamlaşdyrylan Leica UC7 ultramikrotomy ulanyp 80 nm-de bölündi.Bölümler 100 kW Lab6 ýaragy bilen enjamlaşdyrylan JEOL JEM-1400 geçiriş elektron mikroskopy arkaly şekillendirildi.
Bu makalany nädip getirmeli: Wilson, NR we ş.m.SPECC1L ýetmezçiligi bölünen bogunlaryň durnuklylygynyň ýokarlanmagyna we kranial nerw öýjükleriniň delaminasiýasynyň peselmegine getirýär.Ylym.6, 17735;doi: 10.1038 / srep17735 (2016).
Sent-nean, J.-P.Nerw gabygynyň induksiýasy we tapawudy.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience / Eurekah.com, 2006).
Kordero, DR we ş.m.Hereket edýän kranial nerw öýjükleri: kraniofasial ösüşdäki roly.Amerikan lukmançylyk genetikasy Journalurnaly.A bölüm 155A, 270–279, doi: 10.1002 / ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopatiýa: 20 ýylda ösüşi we ösüşi.Çaga lukmany.patologiýa.barlaghana.lukmançylyk.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU we Noten MM orofasial ýyrtyklaryň genetikasynda öňe gidişlik.Molekulýar lukmançylygyň tendensiýalary 17, 725–733, doi: 10.1016 / j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. we Riley, FM Kranial nerw öýjükleriniň göçmeginiň molekulýar mehanizmleri we kraniofasial ösüş döwründe patterlemek.Ösüş 137, 2605–2621, doi: 10.1242 / dev.040048 (2010).
Dikson, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH we Mýurreý, JK Dodak we dodak: genetiki we daşky gurşawa täsirlere düşünmek.tebigy düşündiriş.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038 / nrg2933 (2011).
Ingram, CR we ş.m.Interferon-sazlaýjy faktor-6 (Irf6) - syçanlar üçin deriniň, el-aýaklaryň we kraniofasial sebitiň adaty morfogenezi.Milli genetika.38, 1335–1340, doi: 10.1038 / ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. we ş.m.GRHL3-de agdyklyk edýän mutasiýa, van der Waord sindromyna we agyz periderminiň ösüşine zyýan ýetirýär.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016 / j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ we Juriloff, DM Nerw turbalarynyň ýapylmagynda kemçilikleri bolan syçan mutantlarynyň sanawyny täzeläň we nerw turbalarynyň ýapylmagyna doly genetiki düşünişmeklige tarap öňe gidiň.Çaga dogluş kemçiliklerini derňemek.A bölüm, kliniki we molekulýar teratologiýa 88, 653–669, doi: 10.1002 / bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-töwekgelçilikli PDGFRalpha duýduryşy, p53 bagly öýjükli ýol arkaly skelet ösüşinde diri galmagy we köpelmegi kadalaşdyrýar.Gen ösüşi 28, 1005-1017, doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND we Murdoch, JN Disheveled: konwergensial giňelmäniň nerw turbalarynyň ýapylmagy bilen gatnaşygy.Newrologiýa tendensiýalary.26, 453–455, doi: 10.1016 / S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).